18種活血化瘀中藥對(duì)FactorⅩa的抑制作用

沈舒，王瓊，趙鑫，陳彩娟，李友賓

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046;2.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210028;3.中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 210009)

凝血因子Ⅹa(FactorⅩa，F(xiàn)Ⅹa)是一種絲氨酸蛋白酶，在凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中參與形成凝血酶原復(fù)合物(包括FⅩa、FⅤa、凝血酶原以及 Ca2+)，催化凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟浮Ｄ竸t促使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，激活血小板以及其他凝血因子(FⅤa、FⅤⅢa和FⅩⅢa)，發(fā)揮凝血作用。在凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，每步酶解過程均具有放大效應(yīng)，抑制FⅩa，可以在不影響已有凝血酶的情況下減少催化過程中大量產(chǎn)生的凝血酶，既發(fā)揮抗血栓作用，又保證了正常的止血功能［1］，因此，F(xiàn)Ⅹa成為目前抗血栓治療的重要靶點(diǎn)。活血化瘀中藥有悠久的使用歷史和確切的活血功效［2］，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，不少活血化瘀中藥對(duì)反映外源性和內(nèi)源性凝血途徑的凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血酶時(shí)間(APTT)同時(shí)有延長(zhǎng)作用，推測(cè)其中可能存在具有抑制FⅩa作用的種類。由此，對(duì)18種活血化瘀中藥進(jìn)行了抑制FⅩa活性的篩選實(shí)驗(yàn)。

1 儀器與材料

NANODROP 1000分光光度計(jì)(Thermo，US);梅特勒萬分之一電子天平;Purified FⅩa、生色底物BIOPHEN CS－11(22)(HYPHEN BioMed，批號(hào)分別為EZ007K、229015);拜瑞妥(Bayer AG，批號(hào) BXFD8J1);其余試劑均為分析純。藥材于2010年8月購(gòu)自江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房，經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院李友賓博士鑒定，憑證標(biāo)本存于江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥化學(xué)研究室。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品制備

將18味中藥飲片粉碎，各稱取5g，加7倍量的甲醇超聲提取2次，每次1h，合并提取液，濃縮成浸膏。用DMSO溶解浸膏，制成50mg/mL的樣品溶液。

2.2 FⅩa活性檢測(cè)

反應(yīng)液包括磷酸鹽緩沖液(pH=8.34，含0.300M NaCl，0.065 0M Na2HPO4，0.001 67M KH2PO4)20μL，F(xiàn)Ⅹa溶液(2.5μg/mL)20μL，樣品溶液0.2μL，于 37℃溫育30min后加入底物溶液(2.5mg/mL)20μL，開始反應(yīng)。對(duì)照組以溶劑DMSO代替樣品溶液，空白組以緩沖液代替FⅩa溶液。反應(yīng)開始后分別測(cè)量反應(yīng)體系第0.5～5min在405nm處的吸光度，每0.5min測(cè)1次。通過連續(xù)速率法，將所測(cè)得的吸光度(A)對(duì)時(shí)間(T)做回歸曲線，曲線的斜率代表了酶反應(yīng)的速度，反應(yīng)了酶的活性，與對(duì)照組的回歸曲線斜率相比則可反映抑制劑對(duì)酶抑制作用的強(qiáng)弱。

對(duì)照組的回歸曲線斜率為Vi，樣品組的回歸曲線斜率為 V0，樣品的抑制率(I%)=(Vi－ V0)/Vi［2－3］。

表1 各活血化瘀中藥對(duì)FⅩa的抑制作用(n=2)

3 結(jié)果與討論

18種活血化瘀中藥抑制FⅩa活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。可以看出所篩選的18種活血化瘀中藥提取物在50mg/ml的濃度下，有6種對(duì)FⅩa的抑制活性超過50%，4種抑制活性超過30%，其它種類則抑制作用較弱。目前世界各國(guó)許多科學(xué)家致力于尋找高效、低毒、專一、可口服的FⅩa抑制劑，主要以合成的小分子化合物為主［4－5］，也有從嗜血性無脊椎動(dòng)物體內(nèi)分離到多肽類物質(zhì)［6］。中醫(yī)學(xué)運(yùn)用活血化瘀藥治療血瘀證有上千年的歷史，從中尋找高效低毒專一的FⅩa抑制劑具有很大優(yōu)勢(shì)。我們正在對(duì)其中的幾種中藥進(jìn)一步分離純化，以期獲得對(duì)FⅩa抑制活性較強(qiáng)的單體化合物。

［1］Roehrig S，Straub A，Pohlmann J，et al.Discovery of the novel antithrombotic agent 5－Cholro－N－({(5S)－2－oxo－3－［4－(3－oxomorpholin－4－yl)phenyl］－1，3－oxazolidin－5－yl}methyl)thiophene－2－carboxamide(BYA 59－7939):An oral，direct Factor Ⅹa inhibitor［J］.J Med Chem，2005，48，5900－5908.

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