β-環糊精及其衍生物對黃曲霉毒素B1熒光增強機理研究

張 敏，郭 婷，劉 馨，肖 潔，張宇昊,3，馬 良,3,*

β-環糊精及其衍生物對黃曲霉毒素B1熒光增強機理研究

張 敏1,2，郭 婷1，劉 馨1，肖 潔1，張宇昊1,3，馬 良1,3,*

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400716；2.四川省資陽產品質量監督檢驗所，四川 資陽 641300；3.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400716)

利用光譜法、Benesi-Hildebrand法、熱力學方法研究β-環糊精(β-CD)及其衍生物對黃曲霉毒素B1(AFB1)熒光增強機理，探討溶劑中甲醇體積比、M-β-CD濃度、時間、干擾離子等因素對熒光增強作用的影響。根據Benesi-Hildebrand法確定7種β-環糊精及其衍生物在低濃度時與AFB1包絡比為1:1，高濃度時包絡比為2:1。采用熱力學方法計算了包合常數最大的M-β-CD與AFB1包合過程的熵變(ΔS)、焓變(ΔH)及自由能變化(ΔG)均為負值，說明包合反應是放熱反應且能自發進行，焓變是形成超分子包絡物的主要驅動力。紫外吸收光譜及KI淬滅實驗表明AFB1進入M-β-CD空腔從而使熒光得到保護。得出結論:7種β-環糊精及其衍生物與AFB1通過形成超分子包絡物可大幅增強AFB1熒光發射強度，提高AFB1熒光分析法的檢測靈敏度。

β-環糊精；AFB1；熒光增強；超分子包絡物

黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1， AFB1)是黃曲霉菌和寄生曲霉菌的代謝產物，1993年被世界衛生組織(WTO)的癌癥研究機構劃定為Ⅰ類致癌物，可引起肝細胞變性、壞死，并且分布廣，對人類健康危害極大，因此對AFB1的監測顯得十分重要[1]。

在研究AFB1檢測技術時，使用熒光檢測器來檢測AFB1超微量的已經被廣泛用來作為黃曲霉毒素的高靈敏度的檢測方法[2-3]。但是，AFB1的天然熒光很弱，而且熒光特性受溶劑的影響很大。因此必須研究如何提高熒光檢測的敏感度，讓AFB1的熒光值大大增加，這樣能夠解決方法檢出限較高，不能與國際接軌的問題。現有的AFB1衍生試劑主要有強氧化劑三氟乙酸(TFA)和鹵族元素(碘、溴)以及衍生物過溴化吡啶溴(PBPB)等[4]。但是由于具有種種不足，如加熱衍生、穩定性差、試劑有揮發性、腐蝕性，保存壽命短等[5]。研究安全而穩定的新型熒光增強劑，提高光學系統靈敏度成為研究黃曲霉毒素檢測技術的重要發展方向。

β-環糊精(β-cyclodextrin，β-CD)作為超分子化學最重要的主體，具有外親水內疏水的特殊結構，可以和多類客體分子形成超分子包絡物[6]。Abdel-Shafi[7]、李香[8]、韓建榮[9]等研究表明β-CD及其衍生物分別與1-萘酚-5-磺酸鹽、姜黃素、雙臂苯并15-冠-5形成超分子體系的過程中，熒光強度增加。Wagner[10]、段云青[11]、侯法菊[12]等將β-CD及其衍生物分別作為甘氨酸和賴氨酸、 滅鼠劑溴敵隆、銪(Ⅲ)-強力霉素(DC)體系的熒光增敏試劑，提高了檢測靈敏度，為高靈敏度檢測技術的開發提供了新的思路和方向。Franco[13]、Cavaliere[14]、劉雪芬[15]等研究了β-CDs對AFB1的熒光增強作用，但未對增強機理進行研究。因此，本實驗利用熒光光譜法研究了7種β-CDs與AFB1的超分子相互作用，并采用Benesi-Hildebrand雙倒數法、熱力學、KI淬滅實驗等對增強機理進行探索，對影響包絡反應的溫度、反應時間、反應物質量濃度、干擾離子等因素進行研究，為研究和開發新型高效的熒光增強劑、擴大β-CDs在食品安全中的應用范圍提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

AFB1(稱取0.0010g溶于1mL甲醇中，配制成質量濃度為1.0g/L的標準儲備液，密封后，于冰箱中4℃保存，使用時用甲醇稀釋) 美國Sigma公司。

甲醇(色譜純) 天津四友精細化學品有限公司；β-環糊精、2,4-二甲基-β-環糊精(DM-β-CD)、羥丙基-β-環糊精(HP-β-CD)、羥乙基-β-環糊精(HE-β-CD)、甲基-β-環糊精(M-β-CD)、磺丁基-β-環糊精、葡萄糖基-β-環糊精均為分析純 山東新大精細化工有限公司。

F-2500熒光分光光度儀 日本日立公司；JY2002分析天平(精度0.0001g) 上海精密科學儀器有限公司天平儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 熒光光譜掃描方法

取1mL混合均勻的AFB1樣液，用1.0cm熒光用石英比色杯放置在F-2500熒光分光光度計中進行熒光發射光譜、激發光譜的掃描(激發光源為150W氙弧燈；響應時間:自動；掃描速率:1200nm/min；掃描光譜進行儀器自動校正)，儀器狹縫均置為5nm。固定365nm波長，掃描樣液的熒光發射光譜，得到最佳熒光發射波長；固定440nm波長，掃描樣液的激發光譜，得到最佳激發波長。

1.2.2 熒光衍生測定方法

取特定質量濃度的AFB1標準品溶液，加入一定體積的β-CDs溶液，混合均勻，用1.0cm熒光用石英比色杯，以最佳激發波長的光源激發，于最佳熒光發射波長處測量熒光強度，熒光分光光度計狹縫均置為5nm。

1.2.3 溫度測定方法

將混勻的AFB1-β-CDs溶液于1.0cm熒光用石英比色杯中，加蓋，置于自制控溫裝置中放置2min后，按1.2.2節方法測定熒光強度。

2 結果與分析

2.1 AFB1的熒光光譜

圖1 AFB1熒光激發光譜和發射光譜Fig.1 Excitation and emission spectra of AFB1

由圖1可知，AFB1的熒光體系最大激發波長是365nm，最大發射波長是432 nm。在這種激發波長和發射波長下，可以對AFB1熒光增強作用進行考察。

2.2 β-CD及其衍生物對AFB1的熒光增敏作用

由圖2可知，在室溫(20℃)、溶劑中甲醇體積分數為2%、反應時間2min條件下，除β-CD激發光譜略微紅移(366～370nm)，其余6種β-CDs衍生物均未發生明顯移動。7種β-CDs的加入均未使AFB1的發射峰波長發生明顯移動。說明β-CDs對AFB1可能只起著物理的包絡作用，其熒光性質沒有發生變化。7種β-CDs均使AFB1的熒光激發和發射顯著增強。這種熒光增敏作用應該是由于在疏水作用、范德華力級氫鍵力等非共價鍵作用的驅動下，進入β-CDs空腔形成超分子包絡物所致。分析可能原因為:1)β-CDs空腔為AFB1的生色團提供了一個非極性環境，使其處于去水化狀態，對增進量子效應從而為增強熒光強度提供了有利的條件；2)當AFB1包合進β-CDs分子的空腔后，β-CDs腔的構造保護了AFB1的熒光單級態分子免于從外部淬滅；3)可能由于增加了疏水性AFB1在水中的溶解度，而增加了熒光強度。

圖2 AFB1及AFB1-β-CDs反應物的激發(Ex)和發射(Em)光譜Fig.2 Excitation and emission spectra of AFB1 and AFB1-β-CDs

2.3 包絡物包絡比及包絡常數的測定結果

如果小分子配體具有熒光，當其與大分子作用后熒光強度增大，可利用Benesi-Hildebrand 法研究主客體的結合比。若β-CDs 濃度遠大于客體分子(G)濃度(即[β-CDs]≥[G])，根據改進的Benesi-Hildebrand方程[16]:

[AFB1]/(F－F0)＝1/[β-CDs]·K·α＋1/α (1)

式中:F0和F分別為加入β-CDs前后溶液的熒光強度；α為常數；[AFB1]和[β-CDs]分別為AFB1和CD的總濃度；K是包絡常數。K值的大小反映了β-CDs與客體分子形成包絡物時結合力的強弱。若 [AFB1]/ (F－F0)對1/[β-CDs]的雙倒數圖呈線性，則只形成1:1包合，用所得直線的斜率除以截距計算得K。若雙倒數圖是兩條交叉的直線，則β-CDs在不同濃度時與客體分子形成不同包絡比的包絡物，即低濃度時與AFB1呈1:1包絡，在高濃度時呈2:1包絡。此方法最有意義之處是可以揭示客體分子與環糊精之間的多級包合，這一特點是其他方法所不能及的[17]。包合過程如下:

包絡常數K＝K1·K2[18]，K1、K2分別由兩條交叉直線的斜率與截距計算得出，K1為低濃度時的包絡常數；K2為高濃度時的包絡常數；β-CDs:AFB1表示β-CDs與 AFB1形成1:1包絡物；2β-CDs:AFB1表示β-CDs與AFB1形成2:1包絡物。

圖3 AFB1-CM-β-CD 雙倒數圖Fig.3 Double reciprocal plots for inclusion complexes between AFB1 andβ-CD or its derivatives

為了確保Benesi-Hildebrand方法的可靠性[19]，使初始濃度比cβ-CDs/ρAFB1＝6000mol/μg＞100mol/μg。20℃時，7種β-CDs的雙倒數圖均呈兩條交叉的直線，如圖3所示，說明7種β-CDs與AFB1在低濃度時形成1:1包合，高濃度時形成2:1包合。

表1 AFB1與不同β-CD的包合常數Table 1 Inclusion constants of AFB1 with β-CD or its derivativess

由雙倒數圖計算出各自的包絡常數，見表1。K2均遠小于K1，說明AFB1的一端進入β-CD空腔時，另一端與另一β-CDs分子結合變得困難。這是由于β-CDs空腔直徑較大，與AFB1形成1:1包合后可繼續沿著AFB1分子穿透，干擾了第2個β-CD分子與AFB1的作用。比較7種β-CD的包合常數大小次序為:M-β-CD＞HP-β-CD＞DM-β-CD(葡萄糖基-β-CD)＞β-CD＞HE-β-CD＞磺丁基-β-CD。選擇包合常數最大的M-β-CD作為AFB1熒光增強劑進行進一步研究。

2.4 包絡反應熱力學常數

根據范德霍夫方程lnK＝－ΔH/RT＋ΔS/R，以各溫度條件下的lnK對溫度的倒數(1/T)進行線性回歸，根據直線的斜率和截距可求得包絡物形成過程的熱力學參數: ΔH及ΔS；再根據熱力學定律:ΔH＝ΔG＋TΔS，可求得包合反應的ΔG[16]，結果如表2所示。

表2 不同溫度下M-β-CD- AFB1的包絡常數和熱力學參數Table 2 Effect of temperature on K,ΔG,ΔH andΔS of M-β-CDAFB1

由表2可知，說明隨著溫度的升高，K值逐漸減小，說明包絡物可能趨于離解，客體分子又從M-β-CD空腔內重新進入水相，包絡物的穩定性降低，也表明低溫有利于包絡反應的進行。吉布斯函變ΔG＜0，說明包絡過程是一個自發的過程；焓變ΔH＜0，說明反應是一個放熱過程，其源于主客體分子的范德華力及釋放M-β-CD空腔內高能水分子。分子的幾何形狀引起的空間障礙和空腔對客體分子平移和旋轉自由度的限制將引起負的熵變，而疏水性客體分子在進入空腔前脫去水殼并釋放結合水將引起正的熵變。在本系統中熵變S＜0，說明分子的幾何形狀引起的空間障礙和空腔對客體分子平移和旋轉自由度的限制在包絡過程中起著非常重要的作用。

2.5 KI淬滅實驗

圖4 KI對AFB1及M-β-CD- AFB1體系的熒光淬滅Fig.4 AFB1 fluorescence quenching by KI in the absence and presence of M-β-CD

KI是常用的陰離子淬滅劑，可以淬滅許多小分子的熒光。在動態淬滅過程中，熒光體與淬滅劑分子間的相互作用可用Stern-Volmer方程進行描述F0/F＝1＋Ksv[Q]，其中F0與F分別是加入淬滅劑前后的熒光強度，[Q]為淬滅劑濃度/(mol/L)，Ksv為動態淬滅常數/(L/mol)[9]。如圖4所示，M-β-CD存在時，KI對M-β-CD-AFB1體系熒光的淬滅要比對游離的AFB1弱一些，說明M-β-CD對AFB1的熒光具有保護作用。這為AFB1進入M-β-CD空腔提供了直接證據。

2.6 紫外吸收光譜

圖5 包結前后AFB1的紫外吸收光譜Fig.5 UV absorbance spectra of AFB1 before and after inclusion

由圖5可知，AFB1在紫外區有兩個吸收峰a(264nm)和b(364nm)，b為AFB1分子的吸收峰，推測a可能為構成AFB1分子的雙呋喃環或香豆素的特征吸收峰。加入M-β-CD后吸收光譜形狀沒有發生改變，隨著M-β-CD濃度的變化，吸光度發生了相應的變化，為AFB1進入M-β-CD空腔提供了證據。a峰紫外吸收隨M-β-CD濃度的增加呈規律性的增加，表明AFB1的某一基團進入M-β-CD空腔，發生了分子間的包結作用。

2.7 M-β-CD- AFB1超分子體系熒光強度影響因素

2.7.1 溶劑中的甲醇體積分數

圖6 甲醇體積分數對熒光強度的影響Fig.6 Effect of methanol concentration on fluorescence intensity

由于AFB1溶于有機溶劑，在水中溶解度極低；M-β-CD溶于水，能夠增加AFB1在水相中的溶解度。因此，甲醇在整個反應體系中的比例對熒光值的增強是一個考察的重點因素。由圖6可知，甲醇體積分數越低，熒光值越高。分析原因，有機溶劑主要影響M-β-CD與客體分子間的疏水作用，隨甲醇體積分數的增加主客體間的疏水作用減弱。有人認為兩個過程可能會導致該現象:一是小分子對M-β-CD空腔的競爭作用致使空腔內的客體被置換到水相中，二是M-β-CD、客體分子及小分子形成三元超分子包結物。分析甲醇和AFB1的結構特點不易與M-β-CD形成三元包結物[20]。所以推測是甲醇分子競爭進入M-β-CD空腔，導致AFB1包合不完全，從而使熒光強度降低。

2.7.2 M-β-CD濃度

圖7 M-β-CD濃度對熒光強度的影響Fig. 7 Effect of M-β-CD concentration on fluorescence intensity

由圖7可知，AFB1質量濃度為20μg/L時，隨著M-β-CD濃度的增加，體系的熒光強度時，顯著增大，至22.5mmol/L時，熒光強度基本穩定，繼續增大M-β-CD用量，熒光強度增加很緩慢。

2.7.3 放置時間

圖8 放置時間對熒光強度的影響Fig.8 Effect of sitting time on fluorescence intensity

由圖8可知，加入試劑搖勻后，室溫條件下放置1min熒光強度即可穩定，且較長時間內保持穩定。

2.7.4 干擾離子

由于AFB1主要污染花生、玉米、飼料等，根據文獻[2 0]報道，此類農作物及其加工產品中，含有Ca2+、Mg2+、K+、Na+、Fe3+等元素。考慮到這些元素可能會對測定造成干擾，因此在優化實驗條件下，考察這些共存離子對測定的影響。以空白干擾信號強度的3倍標準差(S)作為判斷干擾與否的標準， 除Fe3+對熒光有強淬滅作用，絕大多數離子不會對測定產生干擾，結果見表3。

表3 共存離子對AFB1熒光強度的影響Table 3 Effect of interfering ions on AFB1 fluorescence intensity

3 結 論

β-CDs與AFB1通過形成超分子包絡物從而大幅度提高了體系的熒光響應值，利用這種特性可提高AFB1熒光檢測的靈敏度。實驗對β-CDs增強AFB1熒光強度的機理進行了研究，Benesi-Hildebrand表明6種β-CDs低濃度時均能與AFB1形成1:1型的超分子包絡物，高濃度時形成2:1型包絡物，從而大大增強AFB1的熒光發射強度。但是在某些情況下，對于2:1型作用體系，Benesi-Hildebrand方程可能會給出錯誤的作用比信息，因此要明確包合比，需在今后進行更嚴謹的研究。實驗選擇了包合常數最大的M-β-CD做進一步研究顯示，M-β-CD與AFB1包合過程的熵變ΔS、焓變ΔH及自由能變化ΔG均為負值，說明包合反應是放熱反應且能自發進行，焓變是形成超分子包絡物的主要驅動力。KI淬滅實驗結果表明AFB1進入M-β-CD空腔，從而熒光得到保護。溶劑中甲醇體積分數、M-β-CD濃度、時間、溫度、干擾離子等對包絡反應均有較大影響。在實際應用中，通過對各影響因素的控制，可以達到最佳熒光增強效果。

[1]付成平, 歐陽華學, 劉瑜. 柱前衍生化高效液相色譜法測定中草藥提取物中的黃曲霉毒素B1[J]. 西南農業學報, 2009, 22(2): 522-524.

[2]FERREIRA I M P L V O, MENDES E, OLIVEIRAl M B P P. Quantification of aflatoxins B1, B2, G1, and G2 in pepper by HPLC/ fluorescence[J]. Journal of Liquid Chromatography Related Technologies, 2004, 27: 325-334.

[3]ABBAS HAMED K, SHIER W T, HORN B W, et al. Cultural methods for aflatoxin detection[J]. Journal of Toxicology: Toxin Reviews. 2004, 23(2/3): 295-315.

[4]馬良. 黃曲霉毒素B1高靈敏度檢測技術研究[D]. 北京: 中國農業科學院院, 2007.

[5]李培武, 馬良, 楊金娥, 等. 糧油產品黃曲霉毒素B1檢測技術研究進展[J]. 中國油料作物學報, 2005, 27(2): 77-81.

[6]童林薈. 環糊精化學: 基礎與應用[M]. 北京: 科學出版社, 2001: 145.

[7]ABDEL-SHAFI A A, AL-SHIHRY S S. Fluorescence enhancement of 1-napthol-5-sulfonate by forming inclusion complex with β-cyclodextrin in aqueous solution[J]. Spectrochimica Acta, 2009,72(3): 533-537.

[8]李香, 林秀麗. β-環糊精及其衍生物對姜黃素的增容和熒光增強作用[J]. 中國醫藥工業雜志, 2008, 39(3): 194-198.

[9]韓建榮, 陳圓圓, 張衡益, 等. 環糊精在水溶液中與雙臂苯并15-冠-5相互作用的熒光行為. 大環化學和超分子化學研究進展: 中國化學會全國第十二屆大環第四屆超分子化學學術討論會論文集[C]. 北京:中國化學會, 2004.

[10]WAGNER B D, McMANUS G J. Enhancement of the fluorescence and stability of O-phthalaldehyde-derived isoindoles of amino acids using hydroxypropyl-β-cyclodextrin[J]. Analytical Biochemistry, 2003, 317: 233-239.

[11]段云青, 閔順耕. 殺鼠劑溴敵隆和環糊精的超分子作用及分析應用[J]. 分析實驗室, 2009, 28(5): 1-5.

[12]侯法菊. 修飾β-環糊精對銪(Ⅲ)-強力霉素體系熒光的增強作用及其分析應用[J]. 化學工程師, 2008, 159(12): 62-64.

[13]FRANCO C M, FENTE F A, VAZQUEZ B I, et al. Interaction between cyclodextrins and aflatoxins Q, M, and P fluorescence and chromatographic studies[J]. Journal of Chromatography A, 1998, 815: 21-29.

[14]CAVALIERE C, FOGLIA P, PASTORINI E, et al. Liquid chromatography tandem mass spectrometric confirmatory method for determining aflatoxin M1 in cow milk comparison between electrospray and atmospheric pressure photoionization sources[J]. Journal of Chromatography A, 2006, 1101: 69-78.

[15]劉雪芬, 李培武, 張文. 環糊精對花生黃曲霉毒素B1熒光增強作用與應用研究[J]. 中國油料作物學報, 2010, 32(4): 546-550.

[16]COLY A, AARON J J. Fluorimetric analysis of pesticides: methods, recent developments and applications[J]. Talanta, 1998, 46(5): 815-843.

[17]何仲貴. 環糊精包合物技術[M]. 北京: 人民衛生出版社, 2008: 109-110.

[18]李香, 林秀麗. β-環糊精及其衍生物對姜黃素的增溶和熒光增強作用[J]. 中國醫藥工業雜志, 2008, 39(3): 194-198.

[19]WANG Rui. Validity and reliability of Benesi-Hildebrand method[J]. Acta Phys-Chim Sin, 2007, 23(9): 1353-1359.

[20]戴良香, 萬書波, 張志萌, 等. 不同類型花生品種主要礦質元素含量分布及相關性分析[J]. 營養學報, 2009, 31(6): 606-608.

Mechanisms Underlying Fluorescence Enhancement of Aflatoxin B1by β-Cyclodextrin and Its Derivatives

ZHANG Min1,2，GUO Ting1，LIU Xin1，XIAO Jie1，ZHANG Yu-hao1,3，MA Liang1,3,*
(1.College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China；2. Product Quality Supervision and Assay Office of Ziyany, Ziyang 641300, China；3. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing 400716, China)

The mechanisms underlying fluorescence enhancement of aflatoxin B1 (AFB1) by β-cyclodextrin (β-CD) and its derivatives were explored using spectroscopy, Benesi-Hidebrand analysis and thermodynamics. Moreover the effects of methanol volume percentage, M-β-CD concentration, reaction time and interfering ions on fluorescence enhancement were analyzed. β-CD and its six derivatives showed an inclusion ratio to AFB1 of 1:1 at low concentrations and 2:1 at high concentrations. The thermodynamic parameters entropy change (ΔS), enthalpy change (ΔH) and free energy change (ΔG) for maximum inclusion constant between M-β-CD and AFB1 were negative, suggesting that the inclusion reaction is exothermic and can occur spontaneously. Enthalpy change was the dominant force during the formation of inclusion complexes. UV absorption spectra and KI quenching experiments showed that AFB1could enter M-β-CD cavity to protect fluorescence. Therefore, βcyclodextrin and its derivatives can allow considerable enhancement in the fluorescence emission intensity of AFB1 by the formation of supramolecular inclusion complexes, resulting in increased sensitivity of AFB1 fluorescence analysis.

β-cyclodextrin；aflatoxin B1；fluorescence enhancement；supramolecular inclusion

TS207.3

A

1002-6630(2012)15-0028-06

2011-07-04

國家“863”計劃項目(2007AA10Z427)；中央高校基本科研業務費專項(XDJK 2009C056)；

西南大學研究生科技創新基金項目(ky2010006)

張敏(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為食品安全與質量控制。E-mail:zmsally@163.com

*通信作者:馬良(1979—)，女，副教授，博士，研究方向為食品安全檢測技術與食品質量控制。E-mail:zhyhml@163.com