堿性β-甘露聚糖酶發酵培養基的優化

畢 靜

堿性β-甘露聚糖酶發酵培養基的優化

畢 靜

(江蘇經貿職業技術學院工程技術學院，江蘇 南京 211168)

選用魔芋粉作為碳源，豆餅粉和谷氨酸鈉作為氮源物質，對發酵培養基進行優化，并進行模型驗證和5L發酵罐生產實驗。結果表明:最佳發酵培養基(g/L，5L發酵罐)為魔芋粉12、豆餅粉15、酵母粉5、NaCl 84.4、谷氨酸鈉3.11、K2HPO4 1.5、MgSO4 0.3、Na2CO3 10，起始pH 9.5～10.0，堿性β-甘露聚糖酶活力最高可達到2610.1U/mL。

堿性甘露聚糖酶；培養基；優化；爬坡試驗

堿性β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是纖維素酶類中的一種，廣泛存在于自然界中。微生物來源的甘露聚糖酶具有酶活高、提取方便和成本低的特點，比動植物來源的有作用pH值、作用溫度范圍和底物專一性等更為廣泛，已成為近年來的研究熱點和工業用酶的主要來源[1]。但自然界中分離的微生物往往只能少量分泌堿性甘露聚糖酶，所以有研究者將微生物產生的堿性甘露聚糖酶基因克隆和測序，并在宿主細胞中表達[2-3]。但是由于表達水平不高，目前堿性甘露聚糖酶的工業化應用成功的較少；還有一些研究者嘗試從菌種誘變及發酵條件優化的角度來提高酶產量[4]，但是這方面的研究工作偏少。本實驗在已有的研究基礎上，應用SAS軟件進行中心組合試驗設計對堿性甘露聚糖酶發酵培養基優化，以提高發酵液中的堿性甘露聚糖酶活，為工業化生產研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

嗜堿芽孢桿菌，從自然界分離得到。

1.2 培養基

發酵培養基(g/L):魔芋粉12、豆餅粉15、NaCl 80、谷氨酸鈉1、酵母粉5、K2HPO41.5、MgSO40.3、Na2CO310，起始pH值調至7.5～8.0，121℃滅菌20min，加入Na2CO3使pH值至9.5～10.0[5]。

RSM試驗基礎培養基(g/L):魔芋粉12、豆餅粉15、酵母粉5、K2HPO41.5、MgSO40.3、Na2CO310。

R S M試驗發酵培養基:將需考察的關鍵因子NaCl和谷氨酸鈉配制成一定質量濃度的母液，再根據試驗設計要求，吸取一定體積該母液添加到三角瓶中，余量用基礎發酵培養基補齊后，按設計要求調p H值。

1.3 儀器與設備

5L發酵罐 上海保興生物設備工程有限公司；L2B-40轉子流量計 浙江余姚流量儀器廠。

1.4 堿性β-甘露聚糖酶活力測定

在0.9mL、質量濃度為0.5g/100mL的槐豆膠中，加入0.1mL以pH 9.6 Gly-NaOH緩沖液作稀釋的酶液于70℃水浴中保溫10min，用DNS法測定還原糖。堿性β-甘露聚糖酶酶活力單位定義為:在上述條件下，每分鐘水解出1μmol/L相當于D-甘露糖的還原糖基所需要的酶量為一個酶活單位。

1.55 L發酵罐實驗

在5L發酵罐上進行驗證實驗。上罐條件為:優化后的發酵培養基3L，實罐121℃滅菌20min，接種量2%，培養溫度37℃，起始pH9.5～10.0，通氣量1.0vvm，攪拌速率500r/min。一般發酵培養周期為32～36h，酶活力不再增加時，即可放罐。

1.6 試驗設計

1.6.1 Pluckett-Burman (PB)試驗

Pluckett-Burman試驗設計是一種兩水平的試驗設計方法，它基于不完全平衡塊原理，能以最少的試驗次數從眾多變量中快速篩選出對實驗結果影響最大的因素[6-8]。

本實驗發酵培養基中有起始pH值、魔芋粉、豆餅粉、酵母粉、谷氨酸鈉、NaCl、MgSO4和K2HPO4共8種成分，它們都對堿性β-甘露聚糖酶的產生有一定的影響。如果全部用來進行試驗設計，費時費力。所以首先選用PB試驗設計篩選出具有顯著影響的因素。

本設計采用試驗次數n＝12的PB設計對這8個因素進行考察，每個因素取兩個水平，高水平(＋)和低水平(－)，PB試驗因素水平設計見表1。

表1 PB試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels used in Pluckett-Burman design

1.6.2 最陡爬坡試驗設計

最陡爬坡試驗能最快逼進最大響應區域，確定中心組合試驗的中心點，保證響應面分析結果的準確有效性。PB試驗得出的一次擬合方程各變量的系數決定爬坡方向和變化步長，如果系數為負，則該因素水平應為遞減，反之遞增，系數越大變化步長越小[9]。

1.6.3 中心組合試驗設計(CCD)

基于PB試驗結果，以最陡爬坡試驗得到的中心點，本階段試驗根據中心旋轉組合設計(CCD)法，對影響堿性β-甘露聚糖酶的關鍵內部因素進行研究和探索。實驗數據經多項式回歸分析得到一個關于響應值與自變量關系的二價經驗模型:

式中:Y為預測響應值(即堿性β-甘露聚糖酶活力)，bi為回歸系數，Xi為自變量。Xi和X0的關系公式為:

式中:Xi為自變量，X0為自變量在中心點時的值，ΔXi為自變量變化的步長。

本實驗均采用SAS軟件9.0進行實驗設計，并對實驗數據作回歸擬合，對擬合方程作顯著性檢驗及方差分析。多項式模型方程擬和的性質由決定系數(R2)及方差分析判定，其統計學上的顯著性由F檢驗確定。所得回歸方程(1)分別對各自變量求偏導數并均令其為0，即可得一個二元一次方程組，通過解此方程組就可以得到堿性β-甘露聚糖酶的最大產出和對應的極值點[10]。

2 結果與分析

2.1 堿性甘露聚糖酶產出的關鍵影響因子的確定

根據試驗方案，設計PB試驗的自變量水平[11]。根據SAS軟件自動生成的八因素二水平的組合，對原始培養基8種成分進行考察，篩選影響堿性β-甘露聚糖酶產出的重要因素。PB試驗結果見表2，其回歸分析見表3。

表2 PB試驗設計及結果Table 2 Pluckett-Burman design arrangement and corresponding experimental results

表3 PB試驗結果的回歸分析Table 3 Regression analysis of the Pluckett-Burman experimental results

為保證結果可靠性，每個試驗組合設置3個平行，響應值Y為堿性β-甘露聚糖酶活力的平均值。用SAS軟件對實驗數據進行回歸分析，得到一次回歸方程:

該模型方程的R2為0.9559，證明該模型極其顯著且合適有效。根據表3中t檢驗結果可知，NaCl和谷氨酸鈉為主要影響因素，在95%和99%置信區間其可信度分別為96.76%和99.38%。

2.2 培養基組成對堿性β-甘露聚糖酶產量的影響

2.2.1 中心組合試驗中心點的確定

根據PB試驗結果可知，NaCl和谷氨酸鈉加入量為產堿性β-甘露聚糖酶的主要影響因素。由方程(1)可知NaCl的系數為負，說明實驗水平下降對堿性β-甘露聚糖酶的產出有積極的影響；谷氨酸鈉的系數為正，說明實驗水平上升對產酶有積極的影響。確定NaCl和谷氨酸鈉的變化步長分別為5g/L和0.2g/L進行最陡爬坡試驗。魔芋粉、豆餅粉、酵母粉、K2HPO4、MgSO4、Na2CO3添加質量濃度和起始pH值保持原水平。試驗設計及結果如表4所示。可知后續中心組合試驗的中心點為NaCl 85.0g/L、谷氨酸鈉3.0g/L。

表4 最陡爬坡試驗設計及其結果Table 4 Steepest ascent test arrangement and corresponding experimental results

2.2.2 堿性β-甘露聚糖酶的中心組合試驗分析與優化

根據最陡爬坡試驗得到的中心點，對NaCl和谷氨酸鈉進行中心試驗組合設計，魔芋粉、豆餅粉、酵母粉、K2HPO4、MgSO4、Na2CO3添加量和起始pH值保持原水平。為使擬合方程具有旋轉性和通用性，中心點重復4次，星號臂長γ＝1.414[12-15]。自變量水平及編碼，試驗設計及結果見表5，二次多項模型方差分析見表6，回歸方程系數及其顯著性分析見表7。

表5 中心組合試驗設計及結果Table 5 Central composite design (CCD) arrangement and corresponding experimental results

表6 二次多項模型方差分析表Table 6 Variance analysis of the fitted quadratic polynomial model based on CCD design

表7 回歸方程系數及其顯著性檢驗Table 7 Regression coefficients and their significance for the regression model based on CCD design

利用SAS9.0軟件，對實驗數據進行二次多項回歸擬合，獲得了二次經驗模擬方程:

二次多項模型方差分析確定顯著因素，由表6的方差分析結果表明，方程差異極顯著(P＝0.0001)，而且各因素系數均有意義(表7)，說明方程的顯著性及可靠性極高。

考察的NaCl和谷氨酸鈉的質量濃度范圍分別為78～92g/L和2.4～3.6g/L時，當NaCl 和谷氨酸鈉質量濃度達到80～90g/L和2.8～3.6g/L 時為最適產酶質量濃度。在較低質量濃度NaCl和較高質量濃度谷氨酸鈉時，可以達到最高酶活力，得到模型極值點為X1＝－0.120、X2＝0.276，對應NaCl 84.4g/L、谷氨酸鈉3.11g/L，此時預測堿性β-甘露聚糖酶活力為2605U/mL。

2.3 模型驗證

為驗證模型準確性和有效性，根據方程(2)得到NaCl和谷氨酸鈉的質量濃度，配制發酵培養基，即最佳發酵培養基(g/L):魔芋粉12、豆餅粉15、酵母粉 5、NaCl 84.4、谷氨酸鈉 3.11、K2HPO41.5、MgSO40.3、Na2CO310，起始pH 9.5～10.0進行搖瓶發酵實驗，得到堿性β-甘露聚糖酶實際酶活力，實驗重復3次，取平均值為2695.0U/mL，符合模型預測值(2688.5U/mL)，可見該模型能準確預見實際發酵情況。

2.45 L發酵罐結果

按照優化后的培養基，在5L發酵罐上進行堿性β-甘露聚糖酶生產實驗，結果顯示，堿性β-甘露聚糖酶活力最高可達到2610.1U/mL，比初始培養基產酶水平(1671U/mL)提高56.2%。可見，該模型能準確預見實際發酵情況，提高堿性β-甘露聚糖酶的產量。

3 結 論

選定魔芋粉作為碳源，豆餅粉和谷氨酸鈉作為氮源物質，對發酵培養基進行優化，最佳發酵培養基(g/L):魔芋粉12、豆餅粉15、酵母粉5、NaCl 84.4、谷氨酸鈉3.11、K2HPO41.5、MgSO40.3、Na2CO310，起始pH 9.5～10.0，進行搖瓶發酵實驗，堿性β-甘露聚糖酶活力為2695.0U/mL，符合模型預測值2688.5U/mL。在5L發酵罐上進行堿性β-甘露聚糖酶生產實驗，結果顯示，堿性β-甘露聚糖酶活最高可達到2610.1U/mL，比初始培養基產酶水平(1671U/mL)提高56.2%。可見，該模型能準確預見實際發酵情況，提高了堿性β-甘露聚糖酶的產量。

[1]張云華. 嗜堿芽孢桿菌N16-5堿性β-甘露聚糖酶的嗜堿機制研究[D]. 哈爾濱: 東北農業大學, 2004.

[2]韋躍華, 毛愛軍, 何永志, 等. 里氏木霉內切-β-甘露聚糖酶基因在畢赤酵母中的表達[J]. 生物工程學報, 2005(6): 878-883.

[3]譚秀華, 武玉永, 馬立新, 等. 耐堿性甘露聚糖酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達[J]. 微生物學報, 2005, 45(4): 543-546.

[4]陳一平, 龍健兒, 廖連華, 等. 芽孢桿菌M50產生β-甘露聚糖酶的條件研究[J]. 微生物學報, 2000, 40(1): 62-68.

[5]畢靜. 生物合成甘露聚糖酶中氮源作用的研究[J]. 江蘇調味副食品, 2011(2): 5-10.

[6]常亞飛. 蘇云金素高產菌蘇云金芽孢桿菌032的育種及發酵工藝優化[D]. 武漢: 華中農業大學, 2005.

[7]何國勇, 張翠萍, 童勝強, 等. 丹參醇沉過程中多糖模型的建立和研究[J]. 亞太傳統醫藥, 2009, 5(5): 21-23.

[8]陳設, 詹曉北, 鄭志永, 等. 厭氧發酵產琥珀酸的培養基優化研究[J].現代化工, 2006, 26(增刊2): 271-274.

[9]常亞飛, 陳守文, 喻子牛. 蘇云金素發酵培養基的優化設計[J]. 中國生物防治, 2006, 22(3): 190-194.

[10]張小朋. 對甜菜夜蛾高毒力的蘇云金芽孢桿菌D1-23菌株的選育及其發酵優化[D]. 武漢: 華中農業大學, 2006.

[11]牛廣財, 嚴寶冬, 朱丹, 等. 響應面法優化黑加侖果醋的發酵條件[J].食品科學, 2012, 33(1): 159-160.

[12]熊冬梅, 鄧澤元, 劉蓉, 等. 高效液相色譜測定銀杏保健品中總黃酮[J]. 食品科學, 2009, 30(22): 256-259.

[13]李運顯, 李夢琴, 吳坤. 響應曲面法優化可食玉米醇溶蛋白膜制備工藝[J]. 食品與發酵工業, 2009, 35(1): 91-95.

[14]邱偉芬, 高瑀瓏. 超高壓番茄汁殺菌條件的優化研究[J]. 食品科學, 2007, 28(2): 59-63.

[15]詹玉新, 謝科生, 齊玉堂. 擠壓膨化技術在玉米胚浸出提油中的應用研究[J]. 糧食與飼料工業, 2010(7): 38-39.

Optimization of Fermentation Medium for Alkaline Mannanase Production

BI Jing
(College of Engineering and Technology, Jiangsu Institute of Economic and Trade Technology, Nanjing 211168, China)

The fermentation medium for producing alkaline mannose using konjac flour as the carbon source and soybean cake powder and sodium glutamate as the nitrogen source was optimized by Pluckett-Burman (PB) design, steepest ascent test and central composite design. Based on a central composite design for three independent variables including NaCl and sodium glutamate concentrations, a predictive mathematical model was built and validated. Meanwhile, scale-up production experiments were done in a 5-L fermentor. Our results indicated that the optimal fermentation medium (g/L) was composed of konjac flour 12, soybean cake powder 15, yeast powder 5, NaCl 84.4, sodium glutamate 3.11, K2HPO41.5, MgSO40.3, Na2CO310, and initial pH 9.5—10.0, yielding an alkaline mannose as high as 2610.1 U/mL.

alkaline mannanase；medium；optimization；steepest ascent test

Q556.2

A

1002-6630(2012)15-0266-04

2012-03-12

畢靜(1965—)，女，工程師，本科，研究方向為食品工程。E-mail:zyz0878@139.com