纖溶豆豉的制備及其對小鼠溶栓效果的評價

李小東，王成濤*，趙 磊，楊雪蓮，張佳嬋

(北京工商大學 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，食品風味化學北京市重點實驗室，北京 100048)

纖溶豆豉的制備及其對小鼠溶栓效果的評價

李小東，王成濤*，趙 磊，楊雪蓮，張佳嬋

(北京工商大學 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，食品風味化學北京市重點實驗室，北京 100048)

利用動物血栓模型，飼喂纖溶豆豉來研究其在動物體內的溶栓作用。通過小鼠腰背部皮下注射10mg/mL角叉菜膠溶液誘發小鼠尾靜脈形成血栓，實驗組A飼喂豆豉纖溶豆豉并自由飲用纖溶豆豉提取液，對照組B(模型小鼠)、對照組C(正常小鼠)分別飼喂全價營養鼠糧，并自由飲水。結果表明：各組小鼠生長情況良好；飼喂纖溶豆豉的實驗組A小鼠體質量先降低后增高，飼喂5d以后尾部形成的血栓長度逐漸變短，10d時凝血酶原時間、凝血酶時間稍有延長，但差異不顯著，15d后凝血酶原時間、凝血酶時間均明顯延長(P＜0.05)，血漿中纖維蛋白原(FIB)含量相應降低，D-二聚體在飼喂10d后呈陽性；而飼喂全價營養鼠糧的對照組B及注射生理鹽水的對照組C，其PT、TT差異均不顯著。因此食用纖溶豆豉能激活機體纖溶系統，抑制凝血系統作用，有助于預防和輔助治療血栓性疾病。

中國豆豉；小鼠血栓模型；血栓長度；纖溶活性；角叉菜膠

豆豉是我國的傳統發酵食品，營養豐富、風味獨特，并且具有開胃增加食欲及預防心腦血管疾病的功效[1]。近年來，我國研究人員對豆豉進行了研究，Wang Chentao等[2]從山東八寶豆豉中分離到一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis DC12-33)，能產生具有溶解血栓作用的豆豉纖溶酶Subtilisin FS33(30kD)，并發現其在體內和體外均具有明顯的降解血栓纖維蛋白的能力。張炳文等[3]也發現豆豉激酶對角叉菜膠造成的小鼠血栓形成呈現一定的劑量效應，說明豆豉激酶對血栓形成具有預防作用。

食品功能因子需要借助胃腸道吸收，口服也是最易接受和方便的給藥途徑。近年來一些肽類、蛋白質類、抗原類等大分子物質，通過選擇合適的載體材料和制備工藝，可防止其被胃腸道酸和酶的破壞，提高其生物利用度。關于蛋白質(酶)、多肽能否通過腸道完整吸收，一直未有定論或存在爭議。現在已發現至少有5種小肽類轉運系統：PepT1、PepT2、HPT-1、HPT-2、PTR家族[4-5]。Lee等[6]研究發現從安德愛勝蚓中純化得到的蚓激酶SPP-501(30kD)通過口服吸收后仍具有抗血栓作用和纖溶活性。Capraro等[7]用蛋白免疫印記法發現未經修飾的藍豆蛋白(68kD糖蛋白)在大鼠小腸和Caco-2細胞模型中均有吸收，吸收后仍有活性。Wood等[8]研究發現用水凝膠包裹的胰島素在Caco-2和HT29 MTX腸上皮細胞模型上有吸收作用。賀華君等[9]研究熒光標記SOD (16kD)的完整吸收，也認為SOD分子可穿越細胞膜進入細胞。本課題組已實驗證明豆豉纖溶酶經靜脈注射的溶栓效果，該酶既能激活無活性的纖溶酶原轉化為活性纖溶酶，也能直接降解血栓纖維蛋白，表現出良好的溶栓性[2,10]和蛋白水解活性[11]。本實驗探討口服纖溶豆豉對動物血栓模型的溶栓效果，以期為豆豉保健品和新型溶栓劑開發提供技術參數和指導。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

ICR小鼠(24只，雄性，體質量(30±2)g)、全價營養鼠糧均有北京大學醫學部實驗動物中心提供；墊料經高溫滅菌，定期更換以保持動物的清潔和干爽；空調控制實驗室溫度為22～24℃，空氣相對濕度控制在(60±6)%，室內照明以自然采光為主，環境較安靜。

1.2 材料與試劑

角叉菜膠(TypeⅠ) 美國Sigma公司；八寶豆豉山東臨沂惟一齋醬園。

檸檬酸鈉、纖維蛋白原、凝血酶(酶活力190Bp)中國食品藥品檢定研究所；凝血酶原時間(PT)測試試劑盒、凝血酶時間(TT)測試試劑盒 北京世帝科學儀器公司；溶栓二聚體(D-dimer)乳膠診斷試劑盒 上海捷門生物技術公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的鑒定

從山東八寶豆豉中分離篩選的高產纖溶酶菌株，初步鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis DC12-33)[2]。

1.3.2 纖溶豆豉及其浸提液的制備

挑選完整無病蟲害的黃豆，清洗、浸泡過夜，蒸煮1h，分裝與500mL罐頭瓶中冷卻至室溫，以體積分數8%的接種量接入B. subtilis DC12-33種子培養液，8層紗布扎口，35℃發酵48h后于4℃冷藏。將發酵豆豉分別加入1.5倍體積生理鹽水浸提2次(3h/次)，合并浸提液，8層紗布過濾得豆豉浸提液。

1.3.3 纖溶酶活力測定

采用改進的纖維蛋白平板法。在直徑9cm培養皿中分別加入8mL牛血纖維蛋白原液(約20mg纖維蛋白原)、5mL 0.1mol/L巴比妥緩沖液(pH7.8)、8mL的10mg/mL瓊脂糖和0.65mL的牛凝血酶溶液(約0.65Bp的凝血酶)，混合均勻，室溫放置1h，平板凝固后即為富纖溶酶原纖維蛋白平板。10μL酶液小心滴加在富纖溶酶原纖維蛋白平板，于37℃孵育18h，透明圈的大小表示纖溶酶活力，同時以尿激酶作為對照，制備標準曲線。

1.3.4 小鼠血栓模型的建立

參考胡三覺等[12]報道的制造小鼠血栓模型方法，略有改動。用乙醚將ICR小鼠輕微麻醉，用70%乙醇在腰背部消毒，以100mg/kg的劑量腰背部皮下注射10mg/mL角叉菜膠溶液(稱取一定量的角叉菜膠(研磨輔助溶解)，用生理鹽水溶解配制成10mg/mL角叉菜膠溶液(現配現用)，注射完成后將小鼠置于溫度低于18℃的環境中飼喂，注意觀察小鼠尾巴變化。小鼠尾尖在4～24h期間出現暗紅色血栓形成區，并逐漸向尾根部擴大，48h后變紫黑色，與正常尾部分界明顯。

1.3.5 實驗設計及分組

將尾巴形成暗紅色血栓的16只小鼠隨機分為2組：實驗組A和對照組B，每組8只；腰背部皮下注射生理鹽水的ICR小鼠為對照組C(8只)。實驗過程中，實驗組A模型小鼠飼喂自制豆豉，并飲用豆豉浸提液；對照組B和對照組C飼喂全價營養鼠糧，并飲用蒸餾水。3組小鼠分別于飼喂5、10、15d后眼眶靜脈叢采血0.3mL (血液與38mg/mL檸檬酸鈉按體積比9:1抗凝)，3000r/min離心10min，收集血漿置入ˉ80℃冰箱保存待測。

1.3.6 小鼠血栓相對長度的計算

用游標卡尺分別在飼喂纖溶豆豉后0、5、10、15d測量實驗組A和對照組B小鼠的血栓形成長度，并且按照L=L1/L2計算小鼠血栓形成相對長度，其中，L表示血栓形成相對長度，L1表示血栓形成長度，L2表示小鼠尾巴總長度。

1.3.7 指標測定

凝血酶原時間、凝血酶時間、D-二聚體分別采用試劑盒檢測；纖維蛋白原(FIB)含量測定采用雙縮脲法檢測[13]。

1.4 數據處理

實驗結果以χˉ±s表示，用t檢驗進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 纖溶豆豉制備及纖溶酶活力

按照1.3.2節方法制備纖溶豆豉，夾起豆粒有較長的細絲，食用后豆豉特征風味明顯。將此發酵豆豉的浸提液用纖維蛋白平板法測定其纖溶酶活力，浸提液酶活力為418300U/L。

2.2 飼喂纖溶豆豉對小鼠體質量和生長情況的影響

每天觀察小鼠飲水、飲食、行為活動等有無異常，分別于實驗5、10、15d稱小鼠體質量，以觀察小鼠的生長情況，各組小鼠生長良好，無一意外死亡，結果如表1所示。

表2 纖溶豆豉對凝血酶原時間、凝血酶時間的影響(χˉ±s，n=8)Table 2 Effect of fibrinolytic Douchi on PT and TT of mice(χˉ±s，n=8)

表1 纖溶豆豉對小鼠體質量的影響(χˉ±s，n=8)Table 1 Effect of fibrinolytic Douchi on body weight of mice (χˉ±s，n=8)

由表1可知，在實驗初期各組小鼠體質量無顯著性差異，隨著飼喂時間的延長，實驗組A小鼠體質量呈“V”字形變化(P＜0.05)，對照組B和對照組C小鼠體質量均呈增加趨勢。適應性喂養階段3組小鼠均飼喂全價營養鼠糧，實驗階段實驗組改喂纖溶豆豉，部分小鼠可能對其不適應，總體進食量較后期少，故實驗組A小鼠體質量在10d前略有降低；但整個實驗期飼喂豆豉對小鼠體質量無較大影響，各組均未見明顯的毒副作用，小鼠生長情況良好。

2.3 飼喂纖維豆豉對小鼠血栓尾巴長度的影響

圖1 纖溶豆豉對小鼠尾部血栓形成相對長度的影響Fig.1 Effect of fibrinolytic Douchi on relative length of infracted regions in the tails of mice

由圖1可知，實驗組A和對照組B在飼喂纖溶豆豉0～5d時，尾部血栓形成相對長度都有變長，但實驗組A與對照組B相比，其血栓形成相對長度的增長趨勢比較緩慢。5d后實驗組A的血栓形成相對長度逐漸變短，而對照組B基本未發生變化。

2.4 飼喂纖溶豆豉對小鼠凝血功能的影響

由表2可知，實驗組A小鼠飼喂第10天，凝血酶原時間和凝血酶時間沒有發生明顯變化，飼喂15d后凝血酶原時間(P＜0.01)和凝血酶時間(P＜0.05)均顯著延長；對照組B在整個飼喂過程中凝血酶原時間、凝血酶時間呈降低趨勢；對照組C無顯著性變化。

2.5 飼喂纖溶豆豉對小鼠纖溶系統的影響

表3 纖溶豆豉對FIB、D-dimer的影響(χˉ±s，n=8)Table 3 Effect of fibrinolytic Douchi on FIB and D-dimer in mice (χˉ±s，n=8)

由表3可知，實驗組小鼠飼喂10、15d FIB含量相應降低，但差異性未達到顯著水平，D-二聚體均呈陽性；對照組B的FIB含量呈先降低后升高變化，D-二聚體均呈陰性；對照組C的FIB含量無顯著性變化，D-二聚體均呈陰性。

3 討 論

3.1 動物血栓模型的復制

血栓的形成是凝血、抗凝、纖溶系統及血液流變學、血管內細胞、血小板等多種因素綜合作用造成[14]。本研究選用角叉菜膠造成小鼠尾部血栓模型，角叉菜膠是從海藻中提取的含硫酸多糖物質，是目前較常用的血栓誘導劑，小鼠經腰背部皮下注射角叉菜膠，引起炎癥損傷血管內皮細胞，致使炎細胞趨化、浸潤，激活外源性凝血系統，造成混合性血栓形成。該血栓模型操作簡單易行，對小鼠傷害小，適用于飲食治療和預防型的血栓模型。

3.2 飼喂纖溶豆豉對小鼠尾部血栓形成的影響

角叉菜膠造成小鼠血栓模型，該模型在血栓尾巴形成后繼續飼喂一段時間，血栓形成尾巴會因組織壞死陸續掉落。本研究在飼喂后期也出現了血栓形成尾巴掉落的現象，為了能準確記錄小鼠尾部血栓形成的長度，避免因血栓形成尾巴的掉落造成較大的誤差，在實驗過程中選擇測量小鼠尾部沒有暗紅色血栓的部分。

本研究中飼喂纖溶豆豉5d時，實驗組A和對照組B的血栓形成相對長度都較0d時變長，這是因為該血栓模型在小鼠注射角叉菜膠72h后尾部血栓形成長度才不再發生變化，而本研究是在小鼠注射角叉菜膠24h后開始飼喂纖溶豆豉，血栓還會繼續形成，因此在飼喂前5d血栓長度會變長；同時實驗組A較之對照組B，其血栓相對長度的增長趨勢比較緩慢， 這說明食用纖溶豆豉有預防血栓形成的作用，這與張炳文等[3]的研究結果相似。飼喂5d以后，實驗組血栓相對長度逐漸變短，而對照組B未發生變化，說明食用纖溶豆豉有治療和緩解血栓形成的作用。3.3飼喂纖溶豆豉對動物凝血系統的作用

凝血酶原時間、凝血酶時間是反映凝血系統變化較敏感和常用的篩選指標，可判斷抗栓藥物的療效。凝血酶原時間延長見于先天性凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅻ、Ⅹ缺乏癥，低(無)纖維蛋白原血癥、DIC、口服抗凝劑等，凝血酶原時間縮短見于高凝狀態、血栓性疾病等。凝血酶時間延長見于纖維蛋白原機能不良癥、纖維蛋白降解產物(FDP)增多等。

本研究中飼喂纖溶豆豉的實驗組小鼠在5d和10d后凝血酶原時間、凝血酶時間兩個指標未出現顯著性變化，但飼喂15d后明顯延長，這說明纖溶豆豉具有一定的抑制機體凝血系統作用，但需要食用一定時間后才可表現，纖溶豆豉可作為預防和控制血栓性疾病發生的保健食品。

3.4 飼喂纖溶豆豉對動物纖溶系統的作用

纖溶系統主要包括纖溶酶原(FIB)的激活與纖維蛋白的降解。纖維蛋白是血栓的主要成分，也是纖溶酶的底物，在溶栓藥物的效果評價中，常測定FDP作為纖維蛋白降解水平指標，但FDP也可以是纖維蛋白酶降解纖維蛋白原的產物，因而FDP的升高并不一定表示血栓的形成或溶解。D-二聚體是纖維蛋白降解的特征性產物，它的升高特異性地指示體內有血栓形成或溶栓治療有效[15]。FIB是纖維蛋白(血栓)的前體，血栓前狀態和血栓性疾病時，機體凝血功能增強，血漿中FIB含量增多[16]。纖溶系統活性增強，FIB被分解，血漿中FIB含量降低，但FIB被纖溶酶過度降解時，常伴有全身出血傾向，應予以注意；凝血酶時間可反映纖溶酶作用纖維蛋白原的情況。

Zhao Jing等[17]研究了蚓激酶(30kD)的腸道吸收，將小鼠十二指腸保溫培養在含蚓激酶的營養液中，發現有10%～15%蚓激酶被腸上皮吸收，最高達30%，并在腸上皮細胞中檢測到了蚓激酶的存在；通過腹腔注射發現小鼠血清中存在約10%蚓激酶，表明這種蛋白質大分子能夠穿腸而過，通過腸上皮進入血液；其功能因子Protease-Ⅲ-1 (Ef P-III-1)具有激活凝血酶原和纖維蛋白原水解的促凝和抗凝雙重功效。本研究考察了飼喂纖溶豆豉對小鼠血栓模型的效果，隨著小鼠食用豆豉時間的延長實驗組FIB含量逐漸減少，10d后血漿 D-二聚體呈陽性，而未飼喂纖溶豆豉對照組A的FIB含量先降低后升高，D-二聚體呈陰性，說明較長時間飼喂纖溶豆豉可激活機體的纖溶系統；飼喂纖溶豆豉的模型小鼠在5d和10d后凝血酶原時間、凝血酶時間未出現顯著性變化，但飼喂15d后明顯延長，說明纖溶豆豉具有一定的抑制機體凝血系統作用，但其詳細機制有待深入研究。由于纖溶豆豉進入胃腸道消化系統及吸收過程中，其活性成分會部分降解，造成活性降低或生成新的功能因子，但也發現了食用纖溶豆豉的預防和輔助治療血栓性疾病的效果，這對于改進傳統豆豉和開發口服溶栓劑具有重要指導意義。

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Preparation of Fibrinolytic Douchi and Evaluation of Its Thrombolytic Effectiveness in vivo

LI Xiao-dong，WANG Cheng-tao*，ZHAO Lei，YANG Xue-lian，ZHANG Jia-chan

(Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

The effect of feeding Douchi was evaluated on mouse thrombosis induced by subcutaneous injection with 10 mg/mL carrageenan at the back waist of mice. ICR mice were divided into three groups: Douchi treatment group (thrombosis model mice fed Douchi and normal saline extract from Douchi), model control group (thrombosis model mice fed full nutrition diet and distilled water) and normal control group (normal mice fed full nutrition diet and distilled water). The results showed that the mice in the Douchi treatment group exhibited an initial decrease and subsequent increase in body weight, a slight increase in prothrombin time (PT) and thrombin time (TT), and a reduction in plasma fibrinogen (FIB) during the experiment. The detection of D-dimer was positive after 10 days of feeding and PT and TT were notably prolonged (P < 0.05) in the mice fed for 15 days. However, PT and TT showed no significant difference between the model control group and normal control group. Therefore, Douchi can activate the function of fibrinolysis, inhibit the function of blood-clotting system, and prevent and treat thrombosis diseases.

Chinese Douchi；thrombosis model；length of infarcted regions；fibrinolytic activity；carrageenan

TS201.4

A

1002-6630(2012)03-0228-04

2011-08-02

北京市屬高校人才強教計劃項目(PHR201008237)；教育部-北京市教委科研重點項目(KM201110011001)；學科與研究生教育-食品學科特色學科群建設項目(PXM2011-014213-113634)

李小東(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：xiaodongwenni@163.com

*通信作者：王成濤(1969—)，男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：wct5566@163.com