嗜酸乳桿菌NX2-6產細菌素的發酵條件優化

烏云達來，陸兆新*，呂鳳霞，別小妹，盧亞萍，孫會剛，查干其勞

(1.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018)

嗜酸乳桿菌NX2-6產細菌素的發酵條件優化

烏云達來1,2，陸兆新1,*，呂鳳霞1，別小妹1，盧亞萍1，孫會剛1，查干其勞1

(1.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018)

在Plackett-Burman試驗結果基礎上，采用響應曲面法(Box-Behnken設計)對嗜酸乳桿菌NX2-6發酵產細菌素的關鍵影響因素，即葡萄糖質量濃度、乙酸鈉質量濃度、檸檬酸三鈉水合物質量濃度及培養時間的最佳水平范圍進行研究和探討。通過對發酵液抑菌圈直徑的二次多項回歸方程求解得知，在葡萄糖質量濃度、乙酸鈉質量濃度、檸檬酸三鈉水合物質量濃度和培養時間分別為60.0、8.0、5.0g/L和36h時，菌株NX2-6的發酵液抑菌圈直徑預測值為21.37mm，驗證實驗抑菌圈直徑實測值與預測值的相關系數R2為0.9918。優化后培養基與基礎培養基相比，發酵液抗菌活性增加約80.0%，由此可見，利用響應曲面法對嗜酸乳桿菌NX2-6發酵產細菌素條件進行優化是經濟有效且科學合理的。

嗜酸乳桿菌；細菌素；發酵條件；優化

細菌素是指由某些細菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產生的一類具有生物活性的蛋白質、多肽或前體多肽，這些物質可以殺滅或抑制與之相同或相似生境的其他微生物[1-2]。許多乳酸菌也能產生具有廣譜抑菌活性的細菌素，其中一部分乳酸菌細菌素可應用于食品保藏。細菌素在食品工業中的應用有助于減少化學防腐劑的添加量，并且降低滅菌強度，使食品更易于常溫保藏，從而保證產品品質和營養[3-5]。許多乳酸菌能產生具有廣譜抑菌活性的細菌素，目前已在革蘭氏陽性菌中發現了50余種羊毛硫細菌素[6]。

傳統的單變量優化試驗存在不考慮各因子之間交互作用的不足，雖然全因子試驗可以解決這一問題，但費時費力[7]。響應曲面分析法已成功地應用于試驗設計、建立模型、影響因素4的評價和最佳條件的確定等[8-9]，并已廣泛應用于許多研究領域，如培養基和培養條件的優化[10-13]、酶學性質和提取技術的研究[14-16]、異黃酮[17-19]及藥物作用的研究[20-21]等方面。采用該法不僅可對影響因子最佳水平范圍及其交互作用進行評價，而且所需的試驗組數相對較少，結果可靠性強，實驗周期短。

筆者從內蒙古錫林郭勒地區牧民家庭中以傳統發酵方法制作的酸馬奶中分離到一株產廣譜抗菌活性物質的嗜酸乳桿菌NX2-6[22]。為了提高該菌株的細菌素產量，本實驗對其產細菌素具有顯著影響的4個因素[23]，即葡萄糖質量濃度、乙酸鈉質量濃度、檸檬酸三鈉水合物質量濃度以及培養時間進行研究。根據Plackett-Burman試驗結果，采用響應曲面法(Box-Behnken設計)研究主要響應因素的最佳水平及其交互作用，確定菌株NX2-6產細菌素的最佳發酵條件，以獲得較高產量的細菌素。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

供試菌株：從內蒙古錫林郭勒地區酸馬奶樣品中分離的嗜酸乳桿菌NX2-6[22]；指示菌株：大腸桿菌AS1.487為南京農業大學食品科技學院酶工程實驗室保藏菌種。

脫脂乳培養基、MRS液體培養基及牛肉膏蛋白胨液體或固體培養基根據文獻[24-25]方法配制并4℃保藏備用。

1.2 方法

1.2.1 供試菌液的制備

將嗜酸乳桿菌NX2-6接種于5mL脫脂乳培養基中，40℃、培養12～24h。傳代培養2次后接種于MRS液體培養基中，40℃培養12h，傳代培養2～3次后將末次培養物于4℃、3000r/min離心10min，棄掉上清液，加入與培養液等量的滅菌生理鹽水(約5mL)，振蕩混勻，再次于4℃、3000r/min離心10min，同法洗滌2次。然后，棄掉上清液的菌體中加入4.5mL滅菌生理鹽水，振蕩混勻，作為供試菌液。

1.2.2 指示菌的培養

將大腸桿菌AS1.487用牛肉膏蛋白胨液體培養基活化，然后于牛肉膏蛋白胨斜面上劃線培養后4℃保藏備用，每2周繼代1次。使用前接種于營養瓊脂液體培養基中，37℃、培養12～24h，使液體培養基中含菌量達到106CFU/mL，備用。

1.2.3 接種量與培養方法

將供試菌液按體積分數2%接種到不同試驗設計的組合培養基中，40℃條件下培養36～60h。

1.2.4 抗菌活性的測定

將發酵液經4℃、3000r/min離心10min后用0.45μm過濾器過濾除菌，過濾上清液以大腸桿菌作為指示菌通過管碟法[26-27]測定其抗菌活性。

1.2.5 發酵條件優化試驗設計

Plackett-Burman試驗結果表明，對菌株NX2-6產細菌素具有顯著影響的因素有葡萄糖質量濃度、乙酸鈉質量濃度、檸檬酸三鈉水合物質量濃度和培養時間[23]。本實驗利用響應曲面法(Box-Behnken設計)對菌株NX2-6產細菌素的顯著影響因素進一步優化。以發酵液抑菌圈直徑為響應值，顯著影響因素的水平為自變量，每個自變量試驗水平編碼分別為ˉ1、0、1(表1)。借助實驗設計軟件Design Expert，采用Box-Behnken設計方案進行試驗設計。

表1 Box-Behnken試驗因素水平及編碼的設計Table 1 Independen variables and their coded and actual values in Box-Behnken design

設該模型通過最小二乘法擬合的二次多項回歸方程為：

1.2.6 模型驗證實驗

根據試驗結果選擇最理想的5組發酵條件進行驗證實驗，并利用SAS(Release 8.01, USA)軟件對試驗數據進行距離相關分析，驗證嗜酸乳桿菌NX2-6產細菌素模型方程的有效性。

2 結果與分析

2.1 響應面法優化嗜酸乳桿菌NX2-6產細菌素發酵條件

根據Plackett-Burman試驗結果，對于影響嗜酸乳桿菌NX2-6產生細菌素不顯著的其他參數，如蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸出粉等，皆選擇Plackett-Burman試驗設計中的高水平，培養基初始pH值為6.0、培養溫度為40℃和接種量為2%。

Box-Behnken試驗設計及結果見表2，利用Design-Expert 6.0.10軟件對表2數據進行二次多元回歸擬合，獲得抑菌圈直徑預測值(Y^)對編碼自變量的二次多項回歸方程見式(2)。

對方程(2)進行方差分析，結果表明所選用的抑菌圈直徑二次多項模型具有極顯著性(P＜0.0001)，校正決定系數R2Adj為0.9605，表明抑菌圈直徑的實測值與預測值之間具有較好的擬合度。

表2 Box-Behnken試驗設計優化發酵條件結果Table 2 Box-Behnken design matrix and actual and predicted inhibition zone diameters

表3 抑菌圈直徑二次多項回歸方程系數及其顯著性檢驗Table 3 Regression coefficients in the fitted regression model for inhibition zone diameter and their significance

各項回歸系數顯著性檢驗(表3)表明，葡萄糖質量濃度、乙酸鈉質量濃度和培養時間對抑菌效果影響顯著，檸檬酸三鈉水合物質量濃度對抑菌效果影響不顯著，而葡萄糖質量濃度和培養時間、乙酸鈉質量濃度和檸檬酸三鈉水合物質量濃度、乙酸鈉質量濃度和培養時間及檸檬酸三鈉水合物質量濃度和培養時間的交互作用對抑菌效果影響顯著，但其他項不顯著。

2.2 抑菌圈直徑響應面分析與優化

圖1 葡萄糖質量濃度和培養時間交互影響抑菌圈直徑的響應面及其等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots for inhibition zone diameter versus glucose concentration and fermentation time

圖1 顯示了在乙酸鈉質量濃度12.0g/L和檸檬酸三鈉水合物質量濃度4.0g/L時，葡萄糖質量濃度與培養時間對抑菌圈直徑的交互影響效應。在培養基中葡萄糖質量濃度較低(30.0g/L)時，抑菌圈直徑隨培養時間的延長而增大，而培養時間較短(36h)時，抑菌圈直徑隨培養基中葡萄糖質量濃度提高而增大，即較低葡萄糖質量濃度和較長培養時間對抑菌圈的效應與較高葡萄糖質量濃度和較短培養時間時的效應是相似的正效應，但后者的效應比前者更強，因此，提高培養基中葡萄糖質量濃度有利于提高細菌素的產量，并且縮短培養時間，從而縮短生產周期。據研究報道，葡萄糖對從酸馬奶酒中分離的兩株乳酸菌[28]和瑞士乳桿菌HF08[29]產抗菌物質也具有促進作用。

圖2 乙酸鈉質量濃度和檸檬酸三鈉水合物質量濃度交互影響抑菌圈直徑的響應面及其等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots for inhibition zone diameter versus sodium acetate and sodium citrate concentrations

圖2顯示了在葡萄糖質量濃度45.0g/L和培養時間48h時，乙酸鈉質量濃度和檸檬酸三鈉水合物質量濃度對抑菌圈直徑的交互影響效應。乙酸鈉質量濃度較低(8.0g/L)時，檸檬酸三鈉水合物質量濃度在1.0～4.8g/L范圍內抑菌圈直徑隨檸檬酸三鈉水合物質量濃度提高而增大。乙酸鈉質量濃度較高(16.0g/L)時，檸檬酸三鈉水合物質量濃度在1.0～3.4g/L范圍內抑菌圈直徑同樣隨檸檬酸三鈉水合物質量濃度提高而增大。但在培養基中較高乙酸鈉質量濃度和較低檸檬酸三鈉水合物質量濃度組合對抑菌圈直徑的增大有更強的正效應。因此培養基中增加乙酸鈉質量濃度，降低檸檬酸三鈉水合物質量濃度有利于細菌素產量的提高。

圖3 乙酸鈉質量濃度和培養時間交互影響抑菌圈直徑的響應面及其等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots for inhibition zone diameter versus sodium acetate concentration and fermentation time

圖3 顯示了在葡萄糖質量濃度45.0g/L和檸檬酸三鈉水合物質量濃度4.0g/L時，乙酸鈉質量濃度和培養時間對抑菌圈直徑的交互影響效應。在培養基中乙酸鈉質量濃度較低(8.0g/L)時，抑菌圈直徑隨培養時間的延長而縮小。而乙酸鈉質量濃度較高(16.0g/L)時，抑菌圈直徑隨培養時間的延長而增大。即低質量濃度乙酸鈉和較短的培養時間及高質量濃度乙酸鈉和較長的培養時間是同樣的正效應。因此，較低的乙酸鈉質量濃度和較短的培養時間內也可得到較高產量的細菌素。

圖4 檬酸三鈉水合物質量濃度和培養時間交互影響抑菌圈直徑的響應面及其等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for inhibition zone diameter versus sodium citrate and fermentation time

圖4 顯示了在葡萄糖質量濃度45.0g/L和乙酸鈉質量濃度12.0g/L時，檸檬酸三鈉水合物質量濃度和培養時間對抑菌圈直徑的交互影響效應。在培養時間較短(36h)時，培養基中檸檬酸三鈉水合物質量濃度在1.0～4.5g/L范圍內，抑菌圈直徑隨檬酸三鈉水合物質量濃度的提高而增大，隨后縮小；在培養時間較長(60h)時，在培養基中檸檬酸三鈉水合物質量濃度在1.0～3.5g/L范圍內，抑菌圈直徑同樣隨檸檬酸三鈉水合物質量濃度的提高而增大，隨后縮小。但前者的效應有利于增大抑菌圈直徑，并且有利于縮短培養時間。因此，適當提高檸檬酸三鈉水合物的質量濃度有利于在較短培養時間內得到較高產量的細菌素。

總之，從提高發酵液細菌素產量和縮短生產周期要求考慮，提高培養基中葡萄糖質量濃度、降低乙酸鈉質量濃度和適當提高檸檬酸三鈉水合物質量濃度有利于在較短的培養時間內能得到產量較高的細菌素。

2.3 模型驗證實驗

鑒于嗜酸乳桿菌NX2-6產生細菌素模型的有效性，根據方程(2)預測結果選擇最理想的5組發酵條件(取值位于上述各因素試驗水平范圍內)進行驗證實驗。對該模型方程求解得出在各因素分別為：葡萄糖質量濃度60.0g/L、乙酸鈉質量濃度8.0g/L、檸檬酸三鈉水合物質量濃度5.0g/L及培養時間36h時，可獲得最大的抑菌圈直徑，預測值為21.37mm(表4)。利用SAS軟件對表中數據進行相關分析得知，嗜酸乳桿菌NX2-6產生的細菌素抑菌圈直徑實測值與預測值的相關系數R2為0.9918，證明此模型是有效的，并且該優化后培養基與基礎培養基相比，發酵液抗菌活性增加約80.0%。因此，利用響應曲面法對嗜酸乳桿菌NX2-6發酵產細菌素條件進行優化具有一定的實用價值和指導意義。

表4 模型驗證實驗結果Table 4 Results of validation experiments under optimal fermentation conditions

3 結 論

通過響應曲面法對嗜酸乳桿菌NX2-6產細菌素具有顯著影響的葡萄糖質量濃度、乙酸鈉質量濃度、檸檬酸三鈉水合物質量濃度以及培養時間的最佳組合水平建立了二次多項數學模型，并利用統計學方法對該模型進行了顯著性檢驗，探討了各因素間的交互作用，優化了影響因素水平。對該模型方程求解得出在各因素分別為：葡萄糖質量濃度60.0g/L、乙酸鈉質量濃度8.0g/L、檸檬酸三鈉水合物質量濃度5.0g/L及培養時間36h時，可獲得最大的抑菌圈直徑，預測值為21.37mm。此預測值被5組驗證實驗所證實，相關系數R2為0.9918，并且優化條件下發酵液抗菌活性增加約80.0%。由此可見，利用響應曲面法對嗜酸乳桿菌NX2-6產生細菌素起顯著影響因素的質量濃度水平及發酵時間進行優化具有顯著效果。

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Optimization of Fermentation Conditions for Bacteriocin Production by Lactobacillus acidophilus NX2-6

WUYUNDALAI1,2，LU Zhao-xin1,*，Feng-xia1，BIE Xiao-mei1，LU Ya-ping1，SUN Hui-gang1，CHAGANQILAO1
(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；2. College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

Three culture medium components including glucose, sodium acetate and sodium citrate and fermentation time were identified as key factors that affect bacteriocin production by Lactobacillus acidophilus NX2-6 using a Plackett-Burman design and their optimal levels were investigated using response surface methodology based on a Box-Behnken experimental desiign. The optimal levels of glucose, sodium acetate and sodium citrate concentrations and fermentation time were determined to be 60.0 g/L, 8.0 g/L, 5.0 g/L and 36 h, respectively based on the established quadratic polynormial regression equation for inhibition zone diameter of fermentaton broth. Under these conditions, the predicted inhibition zone diameter of fermentaton broth was 0.9918. The optimized culture medium resulted in an increase of approximately 80.0% in the antibacterial activity of fermentation broth compared to the basic culture medium. Therefore, response surface methodology can provide an economic, effective and reasonal strategy for the optimization of fermentation conditions for bacteriocin production by Lactobacillus acidophilus NX2-6.

L.acidophilus；bacteriocins；fermentation conditions；optimization

Q939.117

A

1002-6630(2012)03-0179-05

2011-03-04

國家“863”計劃項目(2007AA10Z357)

烏云達來(1975—)，男，副教授，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：wydl@imau.edu.cn

*通信作者：陸兆新(1957—)，男，教授，博士，研究方向為食品微生物與生物技術。E-mail：fmb@njau.edu.cn