MTT法測定甲殼低聚糖對腸道微生物生長的影響

李 娜，肖凱軍，龐 浩，王兆梅,*

(1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510640；2.中國科學院 廣州化學研究所纖維素化學重點實驗室，廣東 廣州 510650)

MTT法測定甲殼低聚糖對腸道微生物生長的影響

李 娜1，肖凱軍1，龐 浩2，王兆梅1,*

(1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510640；2.中國科學院 廣州化學研究所纖維素化學重點實驗室，廣東 廣州 510650)

以腸道益生菌(保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌)和腸道腐敗菌(金黃色葡萄球菌、沙門氏菌)為研究對象，通過用MTT法來考察甲殼低聚糖對腸道微生物生長的影響。結果表明：在一定質量濃度(0.1～0.8g/100mL)范圍內，甲殼低聚糖對腸道益生菌保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌均有明顯的增殖作用；隨著菌體培養基糖(甲殼低聚糖)質量濃度的增大，甲殼低聚糖對腸道腐敗菌金黃色葡萄球菌、沙門氏菌抑制效果增強；同時分子質量1kD的甲殼低聚糖比分子質量3kD的對微生物生長的影響更為顯著。

MTT法；甲殼低聚糖；腸道微生物

甲殼低聚糖(chitosan oligosaccharide，COS)是甲殼素經脫乙?；徒到馍傻囊活惖途酆隙取⒖扇苡谒陌被穷惢衔颷1]，因其具有良好的水溶性、保濕型、抑菌抗菌等生物學活性從而被廣泛應用于化妝品、食品及醫藥方面[2-3]。而這些生物活性的強弱與COS的分子質量和脫乙酰度大小有關[4-6]。彭益強等[7]研究發現在一定的分子質量范圍內，隨著分子質量和殼聚糖質量濃度的增加，殼聚糖對金黃色葡萄球菌，短小芽孢桿菌等陽性菌的抗菌作用效果增強。對大腸桿菌等陰性菌來說，殼聚糖還受到細菌表面性質影響，細菌親水性越好，所帶的負電荷越多，殼聚糖表現抑菌性能越好[8]。

在對低聚殼聚糖進行抑菌實驗的過程中，細菌計數方法的選擇至關重要。傳統的計數方法有血球板計數法、濁度法、菌體干質量法、平板稀釋法等，而平板稀釋法過程繁瑣、耗時長、重復性差，不能及時反映菌體生長情況，而其他幾種方法不能區分細胞死活。而近年來發展起來的四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法具有簡單、快速、靈敏、穩定等特點被用于生物細胞的活性檢測[9-11]。本實驗選擇兩種腸道益生菌(保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌)和兩種腸道腐敗菌(金黃色葡萄球菌、沙門氏菌)，采用MTT法檢測甲殼低聚糖和低聚果糖對其生長活性的影響，為低聚糖和益生菌臨床配伍使用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養基

保加利亞乳桿菌(Lactobecillus bulgaricus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcu themophilus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙門氏菌(Salmonella)，由廣東微生物種質資源庫提供。

保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌用固體MRS培養基培養，金黃色葡萄球菌和沙門氏菌用固體營養瓊脂培養基培養。

1.2 試劑與儀器

甲殼低聚糖(脫乙酰度為72%，分子質量分別為1kD (COS1)和3kD(COS2))為粵式食品 實驗室自制；低聚果糖(FOS，含量55%) 新金山生物科技有限公司；噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO) 美國Sigma公司。

XSP-3CA型單目生物顯微鏡 日本Olympus公司；DG5032型酶聯免疫檢測儀 南京華東電子集團醫療裝備有限責任公司；UV-2102PC型紫外-可見分光光度計 上海Unico公司；PYX-250G-B型光照培養箱 廣東韶關科力實驗儀器有限公司；LS-B35L-I型高壓滅菌鍋 廣州永程實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1MTT比色實驗[12-13]

將活化的細菌溶于滅菌的PBS溶液(pH7.0)[14]，并倍比稀釋成20～27共8個梯度，分別對不同濃度的菌液做MTT比色實驗，同時做平板菌落計數。

用微量吸液器吸取不同濃度的菌液100μL，分別加入96孔酶標板中，每個濃度的樣液做5個復孔，分別加入MTT溶液，放入37℃恒溫培養箱中，20min后取出，向各孔分別加入一定量的DMSO，用全自動酶標儀于最大吸收波長570nm處測定OD值，測量前振動60s。

1.3.2 培養基糖質量濃度與菌株活菌數相關性的建立

用MTT法測定不同濃度菌液的光密度值(OD570nm)，以不同濃度菌液的OD570nm(X)為橫坐標，菌液濃度(Y)為縱坐標作圖，得出不同菌株的OD570nm值-菌液濃度曲線及相關系數。同時采用平板菌落計數[12]測定糖甲殼低聚不同質量濃度條件下的活菌數，間接得出OD570nm值與菌株活菌數的曲線，從而得出不同分子質量的甲殼低聚糖對腸道益生菌和腐敗菌生長的影響。

2 結果與分析

2.1 最優MTT法的建立

MTT法能夠快速測定活菌數目，但是由于其精確度與細菌種類、細菌的生長狀態及其代謝產物有關[15-16]，因此為了達到較高的精確度，必須針對實驗條件下的菌種建立最優的MTT法。通過對各種加入試劑的OD值測定得到表1。

表1 各種干擾試劑條件下的OD570nm值Table 1 Absorbance at 570 nm in the presence of various interference factors

由表1可知，各種液體介質都會對OD570nm值的測量結果造成干擾。其中菌體本身的干擾程度最大，菌體濃度過高，將導致誤差的增大。

以滅活后的待測菌液代替活菌液為空白對照，待測菌液各100μL，以MTT溶液10μL或20μL和是否添加DMSO設置4種反應條件。經過測定4種菌分別在4種反應條件下的OD570nm值與菌液濃度曲線的參數(R2)，得出最佳的實驗方案，結果見表2。

表2 不同菌種的最佳實驗方案Table 2 Optimal experimental designs for different strains

通過對稀釋度為27的菌液做平板菌落計數，得到該濃度菌液所含的細菌濃度。結合表2得出不同菌種在最佳方案下，各個稀釋度菌液對應的OD570nm值和菌液濃度。對OD570nm值-菌液濃度繪制曲線，可得各個細菌的工作曲線及菌液濃度測量范圍及相關系數如表3。

表3 不同菌種的工作曲線方程Table 3 Working curves for different strains

由表3可知，在一定菌液濃度范圍內，OD570nm值和菌液細菌濃度呈現良好的相關性，相關系數可以達到0.99以上，在該濃度范圍內可以保證結果具有較高的精確度。

2.2 甲殼低聚糖對腸道益生菌生長的影響

2.2.1 甲殼低聚糖對保加利亞乳桿菌體外生長的影響

以低聚果糖作陽性對照，同時以質量濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/100mL的不同分子質量的甲殼低聚糖(COS1和COS2)為碳源，用MTT法測定OD570nm值進而得到低聚果糖質量濃度與活菌數量的關系曲線，如圖1所示。

圖1 培養基糖質量濃度對保加利亞乳桿菌生長的影響Fig.1 Effect of oligo-chitosan on the growth of Lactobecillus bulgaricus

由圖1可知，在一定的質量濃度范圍內，低聚果糖、COS1和COS2對保加利亞乳桿菌都有增殖作用，隨著質量濃度的增大，增殖作用越顯著。低聚果糖的最佳增殖質量濃度為0.8g/100mL，但COS2增殖作用沒有低聚果糖顯著。對COS1而言，在質量濃度為0.2g/100mL條件下達到了最佳的增殖效果，且在該質量濃度下增殖作用超過了COS2，略低于低聚果糖。隨著COS1質量濃度的增加，增殖效果開始減弱，當質量濃度達到0.7g/100mL左右，相對增殖作用近似于0，質量濃度超過這一點后，則表現出對微生物生長的抑制作用，可能是因為高質量濃度的低聚糖在培養基中形成了高的滲透壓，對細菌產生了一定的脫水作用，抑制了其生長，質量濃度過低促進作用又不明顯[17]。

2.2.2 甲殼低聚糖對嗜熱乳酸鏈球菌體外生長的影響

圖2 培養基糖質量濃度對嗜熱乳酸鏈球菌生長的影響Fig.2 Effect of oligo-chitosan on the growth of Streptococcu themophilus

由圖2可知，低聚果糖在0～1.0g/100mL質量濃度范圍內對嗜熱乳酸鏈球菌都具有明顯的增殖作用，增殖作用隨著低聚果糖的質量濃度增加而增加。COS1在0～0.6g/100mL質量濃度范圍內對嗜熱乳酸鏈球菌有一定的增殖作用，但增殖作用不顯著。相對COS1而言，COS2在低質量濃度0～0.4g/100mL之間，對嗜熱乳酸鏈球菌有明顯的增殖作用，其效果優于其他兩種糖類，其最佳增殖質量濃度為0.4g/100mL。當質量濃度超過0.6g/100mL后，微生物已經無法完全利用甲殼低聚糖，過量的殼聚糖給細菌的生長帶來阻礙，抑制了細菌的增殖，細菌數量銳減，低于無糖對照組。增殖作用機理可能與其氨基葡萄糖聚合物的性質有關，或者與其易溶于弱酸的特性有關。殼聚糖在酸性環境中溶解形成膠體[18]，這種膠體性質促進了雙歧桿菌、乳酸桿菌的繁殖，但其確切的作用機理，還有待進一步研究。

2.3 甲殼低聚糖對腸道腐敗菌生長的影響

2.3.1 甲殼低聚糖對金黃色葡萄球菌生長的影響

圖3 培養基糖質量濃度對金黃色葡萄球菌生長的影響Fig.3 Effect of oligo-chitosan on the growth of Staphylococcus aureus

由圖3可知，低聚果糖與甲殼低聚糖對金黃色葡萄球菌的生長影響呈現出兩個極端。低聚果糖對金黃色葡萄球菌有顯著的增殖作用，隨著質量濃度的增加而不斷加強。與此同時，COS1與COS2對金黃色葡萄球菌都表現強烈的抑制作用。兩條曲線近乎重疊，0～0.4g/100mL質量濃度范圍內，活菌數量急劇下降，質量濃度超過0.4g/100mL后，活細菌的數量已經很少，培養基中已經基本不生長細菌。由于金黃色葡萄球菌屬于革蘭氏陽性菌，細胞壁含有豐富的磷壁酸，殼聚糖不能通過靜電作用吸附到細菌表面，因此，殼聚糖主要通過表面滲透進入細胞內，吸附細胞體內帶有陰離子的細胞質，并發生絮凝作用，擾亂細胞正常的生理活動，導致殼聚糖誘導達到細菌細胞組分泄漏，從而抑制細菌生長[19]。

2.3.2 甲殼低聚糖對沙門氏菌生長的影響

由圖4可知，低聚果糖對沙門氏菌有顯著增殖的作用，曲線呈現上升趨勢。兩種甲殼低聚糖對沙門氏菌呈現抑制作用，其中COS1對沙門氏菌的抑菌作用顯著高于COS2。沙門氏菌屬于革蘭氏陰性菌，細菌細胞壁排列比較疏散，因此殼聚糖分子進入細菌細胞內與細菌DNA結合, 干擾DNA結構，從而抑制細菌生長。殼聚糖分子質量越小，越容易進入細菌細胞內，所以抑菌效果隨殼聚糖分子質量降低而增強[8]。

圖4 培養基糖質量濃度對沙門氏菌生長的影響Fig.4 Effect of oligo-chitosan on the growth of Salmonella

3 結 論

本實驗研究了兩種不同分子質量的甲殼低聚糖(COS1和COS2)對腸道微生物體外益生菌和腐敗菌生長的影響，結果發現：在一定質量濃度范圍內(0.1～0.8g/100mL)，COS1和COS2促進保加利亞乳桿菌和嗜熱乳酸鏈球菌的生長。COS1和COS2對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌都有較好的抑菌作用，抑菌作用隨著質量濃度的增大而增強。同時低分子質量的甲殼低聚糖COS1對微生物生長的影響更為顯著。與低聚果糖不同，甲殼低聚糖對微生物的生長具有選擇性，即促進益生菌增殖、抑制腐敗菌生長，為益生菌產品研發提供一定的參考價值，也為研究開發合生元產品提供技術支持。

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Effect of Oligo-chitosan on the Growth of Intestinal Microorganisms as Determined by MTT Assay

LI Na1，XIAO Kai-jun1，PANG Hao2，WANG Zhao-mei1,*
(1. College of Light Industry and Food Science, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China；2. Key Laboratory of Cellulose and Lignocellulosics Chemistry, Guangzhou Institute of Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China)

The effect of oligo-chitosan on the growth of intestinal microorganisms was studied using MTT assays. The results indicated that oligo-chitosan could obviously accelerate the proliferation of Lactobecillus bulgaricus and Streptococcu themophilus at the concentration range of 0.1ˉ0.8 g/100 mL, while the antibacterial activity of oligo-chitosan against Staphylococcus aureus and Salmonella was strengthened with increasing oligo-chitosan concentration. The oligo-chitosan with molecular weight of 1 kD revealed more obvious impact on the growth of intestinal microorganisms than the oligo-chitosan with molecular weight of 3 kD. Key words：MTT assay；oligo-chitosan；intestinal microorganisms

TS252.1

A

1002-6630(2012)03-0101-04

2011-03-17

國家自然科學基金項目(31071505)；華南理工大學中央高?；究蒲袠I務費專項(2009ZM0187)；華南理工大學廣東省大學生創新實驗項目(S1010561061)

李娜(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為糖質資源分離純化及應用。E-mail：linadream1986@163.com

*通信作者：王兆梅(1974—)，女，副教授，博士，研究方向為天然多糖生物活性及應用。E-mail：wangzm@scut.edu.cn