四氫小檗紅堿及其前藥的比格犬藥代動(dòng)力學(xué)研究

彭真珍，原 梅，溫 泉，李 樺，趙春杰，楊 征

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850;2.沈陽藥科大學(xué)，遼寧沈陽 110016;3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850)

焦慮癥(anxiety disorder)是一種以持續(xù)性的焦慮、緊張或反復(fù)性發(fā)作的驚恐不安等情緒為主的神經(jīng)癥，主要表現(xiàn)為病人充滿了長久的(持續(xù)在6個(gè)月以上)、過度的、模糊的、不明原因的焦慮和擔(dān)心，并伴有自主神經(jīng)紊亂、肌肉緊張及運(yùn)動(dòng)不安等癥狀。近年來隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、生活節(jié)奏加快和社會(huì)競爭的激烈，焦慮癥患者的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢。抗焦慮藥(anxiolytics)是主要用以減輕焦慮、緊張、恐懼、穩(wěn)定情緒，兼有鎮(zhèn)靜催眠作用的藥物。應(yīng)用抗焦慮藥是臨床上治療焦慮癥的重要方法，目前常用的抗焦慮藥主要有苯二氮艸卓類藥物、5-HT1A部分激動(dòng)劑、選擇性5-HT再攝取抑制劑以及其他新型抗焦慮藥等［1－2］。此外，長期應(yīng)用某些抗抑郁藥也能起到抗焦慮作用，如阿米替林和文拉法辛等。但是，這些藥物在臨床應(yīng)用中均存在諸如作用廣泛、不良反應(yīng)較多、起效緩慢等問題。因此，研究藥效好、副作用低的抗焦慮藥物依然是社會(huì)公共心理衛(wèi)生的迫切需求，已成為神經(jīng)系統(tǒng)藥物的研發(fā)熱點(diǎn)。

四氫小檗紅堿(THB)是小檗堿的衍生物之一，代號(hào)為BJ236-1。前期藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，THB具有較好的抗焦慮效應(yīng)，且無中樞興奮或抑制作用［3］，因此有望成為抗焦慮的候選藥物。但由于THB的水溶性較差，口服生物利用度很低，不利于開發(fā)成為口服藥物。為了改善THB的成藥性，通過生物轉(zhuǎn)化的方法在THB的9位羥基上乙酰化得到其前藥9-乙酰四氫小檗紅堿硫酸鹽(ATHBS)。早期藥代性質(zhì)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，與THB相比，ATHBS在動(dòng)物體內(nèi)的吸收明顯改善，前藥在體內(nèi)能很快釋放出活性成分THB，明顯提高了THB口服生物利用度，這些特點(diǎn)表明ATHBS是具有一定開發(fā)前景的藥物候選物。為了評(píng)價(jià)THB及其前藥的體內(nèi)處置和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，本文首次建立了同時(shí)檢測比格犬全血中ATHBS及THB濃度的LC-MS/MS方法，并研究了比格犬口服和靜注ATHBS后前藥和THB的藥代動(dòng)力學(xué)及口服生物利用度，為ATHBS的進(jìn)一步開發(fā)和臨床研究提供必要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥品和試劑THB(Fig 1)和ATHBS標(biāo)準(zhǔn)品，純度＞99%，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供(中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥復(fù)方研究室合成)。鹽酸小檗堿(BR)，純度＞98%，購自中檢所;乙腈(色譜純)為Fisher公司產(chǎn)品，甲酸、甲酸銨和氫氧化鈉均為分析純。

Fig 1 Chemical structure of THB

1.2儀器Agilent UHPLC 1290液相色譜系統(tǒng)，包括二元輸液泵(G4220A)、自動(dòng)進(jìn)樣器(G4226A)、柱溫箱(G1316C)。Agilent 6410三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜，配備電噴霧離子源(ESI)以及數(shù)據(jù)采集軟件MassHunter B.04.00。高速低溫離心機(jī)(美國Thermo公司)。

1.3比格犬藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)健康♂比格犬5只，體質(zhì)量為(10±2)kg，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK-(軍)2007-004。動(dòng)物隨機(jī)編號(hào)并稱重，采用雙周期自身交叉實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，按3 mg·kg－1劑量給藥。比格犬口服給藥前12h禁食，自由飲水。ATHBS給藥溶液用生理鹽水配制，口服組以1 ml·kg－1的體積灌胃;靜注組以 0.5 ml·kg－1的體積前肢靜注給藥。口服組于給藥前和給藥后5、10、15、30 min、1、2、4、6、8、12 和 24 h 采血約200 μl，靜注組于給藥前和給藥后 2、5、15、30 min、1、2、4、6、8、12 和 24 h 采血約 200 μl。兩組試驗(yàn)之間凈化期為7 d。

1.4LC-MS/MS分析條件取比格犬新鮮全血100 μl，立即加入到提前放置于冰浴的 400 μl乙腈中(含100 μg·L－1內(nèi)標(biāo))，渦旋60 s，4℃，18 800 ×g離心10 min，取上清液400 μl于－20℃凍存待測。樣品測定前再次4℃、18 800×g離心10 min。色譜柱為 Eclipse Plus C18柱(4.6 mm ×100 mm，3.5 μm，Agilent，USA);流動(dòng)相為水(含0.1%甲酸，5 mmol·L－1甲酸銨)-乙腈(含0.1%甲酸);梯度洗脫程序?yàn)?～2 min 35%B，2～3 min 90%B，3～3.5 min 90%B，3.5～4 min 35%B，4～5 min 35%B;流速為0.6 ml·min－1;柱溫 30 ℃;進(jìn)樣體積 2 μl;總洗脫時(shí)間為5 min。質(zhì)譜條件:離子源為ESI，正離子模式檢測;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描方式定量;毛細(xì)管電壓3 800 V;源溫度為350℃;霧化氣(NEB)為40 psi;用于定量分析的離子對(duì)分別為:ATHBS m/z 368→ m/z 176.1，THB m/z 326→ m/z 176.1 和 BR m/z 336.3→ m/z 320.1。

1.5方法學(xué)驗(yàn)證用采自6條犬的混合空白犬血90 μl加入10 μl系列濃度的ATHBS和THB 混合工作液，配制濃度范圍為 2 ～2 000 μg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，按“1.4”描述的方法處理樣品并測定，得到方法的線性范圍和最低定量限。另配制濃度為5、100、1 500 μg·L－1的 ATHBS 和 THB 的混合質(zhì)控樣品各5份，連續(xù)3 d，每日測定5次，用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的藥物濃度，分別計(jì)算批內(nèi)和批間的精密度與準(zhǔn)確度。在3個(gè)質(zhì)控濃度水平，以全血加標(biāo)樣品的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積之比，計(jì)算方法的回收率。另取空白血樣按“1.4”描述的方法處理，得到提取后的空白樣品，以提取后空白加標(biāo)樣品的峰面積與流動(dòng)相加標(biāo)樣品的峰面積之比，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。在低、中和高3個(gè)質(zhì)控濃度水平，考察了ATHBS和THB的處理樣品在4℃放置24 h，冰浴放置2 h以及－20℃放置不同天數(shù)的穩(wěn)定性。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析THB的血藥濃度－時(shí)間曲線用WinNonlin軟件(Version 5.2.1，美國)的非房室模型進(jìn)行擬合，得到藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。Cmax為實(shí)測的最大血藥濃度，Tmax為口服給藥后血藥濃度達(dá)峰時(shí)間為藥物末端消除半衰期，MRT為藥物在體內(nèi)平均滯留時(shí)間，血藥濃度－時(shí)間曲線下面積AUC(0-t)由梯形法計(jì)算得到，Vd為穩(wěn)態(tài)時(shí)表觀分布容積，CL為清除率。絕對(duì)生物利用度計(jì)算公式如下:

2 結(jié)果

2.1LC-MS/MS定量方法學(xué)驗(yàn)證本研究全面考察了LC-MS/MS同時(shí)定量檢測犬血中THB和ATHBS的方法學(xué)。Fig 2是空白、空白加標(biāo)和實(shí)際血樣的MRM色譜圖，血樣中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測物和內(nèi)標(biāo)的測定，THB、ATHBS和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為2.52、3.07和3.90 min。THB和 ATHBS的標(biāo)曲在2～2 000 μg·L－1的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r＞0.9985)，二者的定量下限均為 2 μg·L－1。THB和ATHBS低、中和高3個(gè)濃度的回收率分別大于78.74%和75.52%;全血基質(zhì)對(duì)THB和ATHBS測定的影響很小，二者的基質(zhì)效應(yīng)分別在94.59%～98.91%和100.81%～108.85%的范圍內(nèi)。THB和ATHBS的日內(nèi)和日間精密度(RSD)分別＜10.79%和＜6.57%，準(zhǔn)確度(RE)在－10.30%～3.92%的范圍內(nèi)，符合新藥臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究生物樣品定量分析的要求，結(jié)果分別見Tab 1，2。在現(xiàn)行條件下，THB和ATHBS的低、中和高3個(gè)濃度在全血前處理樣品中4℃放置24 h，冰浴放置2 h以及－20℃放置27 d的穩(wěn)定性也符合要求，實(shí)測濃度與配制濃度之間的相對(duì)誤差(RE)分別＜11.68%和11.13%。上述結(jié)果表明，本文建立的同時(shí)定量測定犬血中THB和ATHBS的LC-MS/MS方法的專一性、重現(xiàn)性和靈敏度均符合臨床前藥代動(dòng)力學(xué)樣品分析的要求，可以用于比格犬藥代動(dòng)力學(xué)研究。

Tab 1 Intra-and inter-day precisions and accuracies of THB in dog blood(±s)

Tab 1 Intra-and inter-day precisions and accuracies of THB in dog blood(±s)

Nominal Conc/μg·L －1 Inter-day(n=5)Measured Conc/μg·L －1RSD/% RE/%Intra-day(n=15)Measured Conc/μg·L－1RSD/% RE/%5 4.48 ±0.18 3.91 －10.30 5.06 ±0.55 10.79 1.26 100 102.10 ±0.82 0.80 2.10 101.78 ±7.43 7.30 1.78 1500 1 558.80 ±22.34 1.43 3.92 1 511.86 ±59.52 3.94 0.79

Tab 2 Intra-and inter-day precisions and accuracies of ATHBS in dog blood(±s)

Tab 2 Intra-and inter-day precisions and accuracies of ATHBS in dog blood(±s)

Nominal Conc/μg·L －1 Inter-day(n=5)Measured Conc/μg·L －1RSD/% RE/%Intra-day(n=15)Measured Conc/μg·L－1RSD/% RE/%5 4.79 ±0.11 2.38 －4.26 4.90 ±0.32 6.57 －1.93 100 101.00 ±1.37 1.35 1.00 101.50 ±4.42 4.36 1.50 1 500 1 543.05 ±26.48 1.72 2.87 1 511.76 ±41.50 2.75 0.78

Fig 2 Representative MRM chromatograms of(A)blank blood sample，(B)blank sample spiked with THB，ATHBS and IS，(C)Beagle dog blood sample collected at 10 min after oral administration of 3 mg·kg－1ATHBS

2.2比格犬靜注和口服藥代動(dòng)力學(xué)采用雙周期自身交叉實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究了比格犬靜注和口服ATHBS(3 mg·kg－1)后全血中前藥和THB的藥代動(dòng)力學(xué)和口服生物利用度。比格犬靜注ATHBS后2 min時(shí)的平均血濃度為(144.17±39.30)μg·L－1，隨之血中濃度快速下降，所有受試犬給藥1 h后ATHBS血濃度均低于檢測限。口服給藥后5～30 min，ATHBS的血濃度波動(dòng)很大，犬之間的個(gè)體差異也較大，30 min后大多數(shù)比格犬ATHBS的血濃度低于檢測限。靜注和口服后均未能得到完整的ATHBS藥代動(dòng)力學(xué)曲線。

Tab 3 Pharmacokinetic parameters of THB in Beagle dogs after oral or intravenous administration of 3 mg·kg－1ATHBS(±s，n=5)

Tab 3 Pharmacokinetic parameters of THB in Beagle dogs after oral or intravenous administration of 3 mg·kg－1ATHBS(±s，n=5)

Parameter Unit iv Oral T 7.03 ±1.77 5.89 ±3.95 AUC(0-t) μg·h·L－1 718.64 ±143.01 179.62 ±91.64 AUC(0-∞) μg·h·L－1 778.57 ±162.73 203.95 ±97.10 Tmax h － 0.23 ±0.04 Cmax μg·L－1 605.99 ±102.88 77.71 ±26.60 Vd L·kg－1 39.15 ±5.07 －CL ml·min－1·kg－166.65 ±14.81 －MRT(0-t) h 4.26 ±1.40 5.62 ±1.88 F 12 h%26.2

Fig 3 Mean blood concentration-time profiles of THB in Beagle dogs after oral and intravenous administrations of 3 mg·kg－1ATHBS(±s，n=5)

比格犬靜注和口服ATHBS后活性成分THB的平均血藥濃度－時(shí)間曲線見Fig 3。以非房室模型進(jìn)行擬合得到的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，見Tab 3。比格犬口服和靜注ATHBS后在血中可迅速轉(zhuǎn)化成活性代謝產(chǎn)物THB，靜注組的THB血藥濃度在第1個(gè)采樣點(diǎn)(2 min)即達(dá)到(605.99±102.88)μg·L－1的峰值，隨后血藥濃度呈雙相下降，平均消除半衰期為7.03h。口服組的THB血藥濃度出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，第1個(gè)峰值出現(xiàn)在 15min左右，Cmax的均值為(77.71±26.60)μg·L－1，第2 個(gè)小峰出現(xiàn)在給藥后6 h，平均血藥濃度為(16.43±15.05)μg·L－1。隨后血藥濃度的下降與靜注組相似，平均消除半衰期為5.89 h，與靜注組相比差異無顯著性。以比格犬血中的THB暴露(AUC)計(jì)算得到口服給藥的絕對(duì)生物利用度為26.2%。

3 討論

本研究首次建立了同時(shí)測定比格犬全血中ATHBS和THB的LC-MS/MS方法，該方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，可同時(shí)定量分析前藥和活性代謝產(chǎn)物。此方法不僅已用于比格犬藥代動(dòng)力學(xué)的研究，也易于推廣至其它臨床前動(dòng)物或人體試驗(yàn)。在方法建立初期發(fā)現(xiàn)，ATHBS結(jié)構(gòu)中含有酯鍵，易被血漿中的酯酶水解，在全血和血漿中極不穩(wěn)定。如果按照常規(guī)方法分離血漿或取全血后批次處理血樣本，ATHBS在處理過程中就會(huì)部分發(fā)生降解，生成THB，因而不能準(zhǔn)確反映前藥和活性產(chǎn)物在生物體內(nèi)的實(shí)際濃度。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終確定采集全血后立即加入預(yù)先冰冷的乙腈，終止酯酶水解反應(yīng)并沉淀蛋白，隨后低溫離心分離以阻止全血中酯酶對(duì)藥物的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化作用。方法學(xué)驗(yàn)證的結(jié)果表明，前處理方法簡便可行，解決了前藥在試管中可能轉(zhuǎn)化為活性產(chǎn)物、導(dǎo)致血藥濃度檢測出現(xiàn)假象的問題。

比格犬單次靜注和口服給予ATHBS后，在全血中能迅速轉(zhuǎn)化成活性代謝產(chǎn)物THB。口服組THB達(dá)峰迅速，體內(nèi)吸收過程近似于靜脈給藥，但整體血藥濃度低于靜注組，這可能與口服組的THB在經(jīng)ATHBS轉(zhuǎn)化的同時(shí)在體內(nèi)經(jīng)歷進(jìn)一步的肝腸代謝有關(guān)。體外研究結(jié)果表明，THB在肝微粒體中能較快代謝轉(zhuǎn)化，形成其它氧化代謝產(chǎn)物(未發(fā)表結(jié)果)。靜注組前藥的血藥濃度很快降至定量檢測限之下，而THB的血藥濃度在首個(gè)采樣點(diǎn)即達(dá)到峰值，幾乎沒有滯后期，表明前藥的體內(nèi)行為符合設(shè)計(jì)要求，明顯改善了活性成分的吸收，THB是血循環(huán)中的主要成份并發(fā)揮藥理作用。THB的靜注清除率(CL)為(66.65 ±14.81)ml·min－1·kg－1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于比格犬的肝臟血漿流量(30 ml·min－1·kg－1)［4］，提示其體內(nèi)首過效應(yīng)較強(qiáng)。穩(wěn)態(tài)分布容積(Vd)為(39.15 ±5.07)L·kg－1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于比格犬的全身水含量(0.6 L·kg－1)［4］，提示藥物有廣泛的血管外組織分布。雖然口服前藥后THB的血藥濃度在比格犬體內(nèi)消除較快，但其口服生物利用度為26.2%，與THB直接給藥相比有明顯提高。

口服ATHBS后THB在體內(nèi)也較快達(dá)峰，并在6h左右二次達(dá)峰，而靜脈注射未見此現(xiàn)象。文獻(xiàn)報(bào)道，口服小檗堿不僅能對(duì)抗和抑制感染，而且還發(fā)現(xiàn)其具有阻斷胃腸道平滑肌α受體的作用，從而減慢胃腸道蠕動(dòng)［5］。此外，小檗堿的藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，動(dòng)物和人口服小檗堿后均出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象［6－7］，因此小檗堿及其衍生物THB對(duì)胃腸道蠕動(dòng)的減慢是可能造成雙峰或多峰現(xiàn)象的原因之一［8］，可考慮在后期研究中同時(shí)給予咖啡因等促進(jìn)腸道蠕動(dòng)的藥物，觀察對(duì)THB雙峰現(xiàn)象的影響。

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