鹽酸阿霉素殼聚糖納米粒大鼠鼻腔給藥的腦內藥動學研究

王叢瑤，鄭杭生，谷滿倉，陳蘋蘋，金 滔，李范珠

(浙江中醫藥大學藥學院，浙江杭州 310053)

鹽酸阿霉素(adriamycin hydrochloride，ADM)屬蒽環類抗腫瘤抗生素，具有抗癌譜廣、活性強、療效確切等優點，近年來臨床研究發現其對腦膠質瘤亦具有較好的療效［1］。目前ADM臨床主要用藥方式為靜脈注射，藥效迅速、劑量準確;然而ADM靜脈給藥難以通過血腦屏障，且存在心臟毒性、骨髓抑制等不良反應，造成患者順應性差，因此在一定程度上限制了其用于腦膠質瘤的治療［2－3］。鼻腔給藥(intranasal administration，i.n.)可以使藥物通過上鼻甲吸收進入腦脊液，從而進入中樞神經系統，有效增加腦內藥物濃度，如舒馬曲坦［4］，它是已被FDA批準的用于治療偏頭痛的經鼻腔給藥的藥物。納米粒(nanoparticles，NPs)是一種新型靶向膠態藥物載體，具有低毒、高效、緩釋等優點，且能實現藥物的靶向傳遞［5］。Orthmann 等［6］亦指出納米粒可有效轉運藥物通過血腦屏障，是腦靶向給藥的理想載體之一。殼聚糖(chitosan，CS)作為一種新型的載體材料，可以控制藥物釋放、延長藥物療效、增強制劑靶向性，且具有安全無毒、生物相容性良好等優點，已被廣泛應用于制備各類納米粒。我們實驗室以殼聚糖為載體材料成功制備了ADM納米粒(ADM-CS-NPs)，然而關于該給藥系統經鼻腔給藥是否增加腦內ADM的濃度，目前國內外尚未見相關報道。因此本課題研究ADM-CS-NPs鼻腔給藥后的腦內藥動學特性，以期考察ADM-CS-NPs經鼻腔給藥提高腦內ADM濃度的可行性。

1 材料

1.1藥品與試劑鹽酸阿霉素(浙江海正制藥有限公司，純度＞98%，批號090320);鹽酸阿霉素標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號110757-200206);人工腦脊液(1.0 mmol·L－1MgCl2，145.0 mmol·L－1NaCl，1.2 mmol·L－1CaCl2，2.7 mmol·L－1KCl，0.45 mmol·L－1NaH2PO4，1.55 mmol·L－1Na2HPO4，pH=7.4);水合氯醛(上海化學試劑采購供應五聯化工廠，批號20090401);甲醇(色譜純，美國 Honeywell Burdick＆Jackson公司，批號10071753);其他試劑均為分析純。

1.2儀器Agilent1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司);透射電子顯微鏡(日本 Jeol公司);Malvern Measurement粒度測定儀(英國Malvern公司);OptimaMAX Uitrac-elrifuge超速離心機(美國Beckman公司);大鼠鼻黏膜給藥裝置(專利:ZL200520013525.5);微透析腦立體定位架及實驗裝置系統(美國BAS公司);微透析腦探針(美國BAS公司)。

1.3實驗動物清潔級SD大鼠(300±10)g，♂，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供(合格證號SCXK(滬2007-0005))。所有動物實驗均按照浙江大學動物飼養和使用指南進行。

2 方法

2.1ADM-CS-NPs的制備稱取1 mg ADM和10 mg殼聚糖，溶于10 ml體積分數為0.1的乙酸溶液中，用0.01 mol·L－1氫氧化鈉溶液調節 pH值至5.0，在恒速磁力攪拌(900 r·min－1)下緩慢滴入1.2 g·L－1的三聚磷酸鈉(sodium tripolyphosphate，TPP)溶液2 ml，繼續同條件下攪拌30 min，探頭超聲3 min，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，得ADM-CSNPs膠體溶液。將制得的膠體溶液低溫超速離心40 min(4℃，40 000 r·min－1)，棄去上清液，沉淀物用蒸餾水洗滌3次后凍干，即得ADM-CS-NPs凍干粉。

2.2ADM-CS-NPs的質量評價取適量凍干粉加水稀釋一定倍數，滴于專用銅網上，用1.5%磷鎢酸染色，自然晾干，用透射電子顯微鏡觀察外觀形態;用粒度測定儀測定ADM-CS-NPs的粒徑;采用超速離心法［7］測定包封率，并測定載藥量。

2.3腦透析液中ADM測定方法的建立

2.3.1色譜條件色譜柱:Platisil ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇 －0.2% 磷酸(50 ∶50);流速:1.0 ml·min－1;柱溫:25℃;檢測波長:233 nm;進樣量:20 μl。

2.3.2專屬性考察分別取空白透析液、空白透析液添加ADM對照品溶液、ADM-CS-NPs大鼠鼻腔給藥后的透析液樣品，按“2.3.1”項下條件考察專屬性。

2.3.3標準曲線制備精密稱取減壓干燥至恒重的ADM對照品2.00 mg，置于10 ml量瓶中，用超純水溶解、定容，作為ADM對照品貯備液。以人工腦脊液將對照品貯備液稀釋成2.0、10.0、20.0、40.0、56.0、72.0、80.0、160 mg·L－1系列濃度的標準溶液，按“2.3.1”項下條件測定，記錄峰面積，以峰面積(A)對藥物質量濃度(C)進行線性回歸，繪制標準曲線。

2.3.4精密度及方法回收率測定精密移取低(20.0 mg·L－1)、中(80.0 mg·L－1)、高(160 mg·L－1)3個濃度的標準溶液適量，按“2.3.1”項下條件操作，分別在1日內測定5次和連續測定5日(每日測定1次)，記錄峰面積，考察方法的日內和日間精密度。

分別配制低(20.0 mg·L－1)、中(80.0 mg·L－1)、高(160 mg·L－1)3 個濃度的人工腦脊液樣品各3份，按“2.3.1”項下條件操作，記錄峰面積，計算方法回收率。

2.4腦內藥動學研究

2.4.1大鼠腦微透析手術SD大鼠用10%的水合氯醛(300 mg·kg－1)腹腔注射麻醉，其頭部固定于大鼠腦立體定位儀上，暴露顱骨，定位前囟，并以前囟為微透析探針定位的參考點。在前囟后5.2 mm、矢狀線右旁開5.1 mm的骨表面處，用牙科高速鉆機在顱骨上鉆開一能插入微透析探針底座(MD-2251)的小洞。將微透析探針植入腦骨表面下8.0 mm，即右側海馬，并用牙托粉和顱骨螺釘將底座固定于顱骨上。術后大鼠單籠生理恢復7 d，溫度(23±1)℃，相對濕度50% ～70%，晝夜12 h人工交替，自由飲食和飲水。

2.4.2微透析探針在體回收率運用反微透析法測定ADM腦微透析探針在體回收率。按“2.4.1”項下方法操作，微透析腦探針(MD-2200)埋植手術結束后，以濃度分別為10.0、50.0 和100 μg·L－1的ADM 灌流液灌流，流速為2 μl·min－1，每 30 min 收集1次透析液，共收集8 h。高效液相色譜法測定ADM的濃度，根據下述公式計算探針在右側海馬的在體回收率，用于透析部位透析液中實際藥物濃度的校正。

Cdia、Cper和CBIF分別為透析液、灌流液和腦組織間液中的ADM濃度。在反透析過程中，假設探針周圍腦組織間液中ADM濃度為零(CBIF=0)。

2.4.3給藥方案及樣品采集給藥方案:將24只SD♂大鼠隨機分成4組(每組6只):ADM-Sol鼻腔給藥組［ADM-Sol(i.n.)］、ADM-Sol靜脈注射組［ADM-Sol(i.v.)］、ADM-CS-NPs鼻腔給藥組［ADMCS-NPs(i.n.)］和 ADM-CS-NPs靜脈注射組［ADMCS-NPs(i.v.)］。給藥劑量為 1.45 mg·kg－1ADM。實驗前24 h大鼠禁食但自由飲水。

樣品采集:按“2.4.1”項下方法進行手術，微透析腦探針(MD-2200)手術結束后灌流人工腦脊液，流速為 3 μl·min－1，平衡 30 min 后，流速調為 2 μl·min－1。采用大鼠鼻黏膜給藥裝置給藥，同時使用自動恒溫冷凍收集器收集透析液，每10 min收集1次，連續收集1 h，再每1 h收集1次透析液，連續自動收集24 h。收集結束后大鼠腹腔注射過量戊巴比妥鈉麻醉后，用4%多聚甲醛溶液心臟灌注固定。取大鼠大腦4 μm冠狀切片，顯微鏡下觀察右側海馬部位。植入部位不正確數據不予使用。透析液樣品按“2.3.1”項下條件測定，通過ADM在體回收率校正，得到各時間點的ADM實際濃度，繪制ADM海馬部位的藥物濃度－時間曲線。

2.4.4數據處理數據處理:Tmax和Cmax以實測值計，梯形法計算 AUC0→11h，統計矩法計算 MRT。用SPSS17.0軟件進行方差分析，比較 ADM-Sol(i.n.)組、ADM-Sol(i.v.)組、ADM-CS-NPs(i.n.)組、ADM-CS-NPs(i.v.)組間Cmax、AUC0→11h、MRT 的差異。

3 結果

3.1ADM-CS-NPs的質量評價透射電子顯微鏡觀察發現ADM-CS-NPs呈圓形或類圓形，表面圓滑，大小及分布較均勻，粒子之間未見粘連和聚集現象(Fig 1)。測得ADM-CS-NPs平均粒徑為(98.80±0.70)nm，PDI為(0.084±0.001)。測得包封率和載藥量分別為(78.37±1.52)%和(4.46±0.16)%。

Fig 1 Transmission electron micrograph of ADM-CS-NPs(×80 000)

3.2透析液中ADM方法學考察透析液中內源性物質不干擾樣品的色譜分析，方法專屬性強。腦脊液中ADM含量測定的標準曲線方程為:A=5.569 8 C+17.085，r=0.997 2(n=6)，線性范圍2.0 mg·L－1～160 mg·L－1。低、中、高濃度的標準溶液的日內RSD分別為2.57%、1.72%、1.42%(n=5);日間 RSD分別為3.12%、2.37%、2.21%(n=5);低、中、高濃度的樣品的方法回收率分別為93.61%、98.08%、101.34%，RSD分別為 2.98%、2.15%、1.80%(n=3)。說明方法精密度與準確度良好。

3.3腦內藥動學結果

3.3.1ADM微透析腦探針在體回收率測定ADM微透析腦探針在大鼠海馬部位的在體平均回收率為(13.54±0.35)%。

3.3.2藥物濃度－時間曲線大鼠給予ADM-Sol(i.n.)、ADM-Sol(i.v.)、ADM-CS-NPs(i.n.)、ADM-CS-NPs(i.v.)后腦脊液中的平均藥物濃度－時間曲線見Fig 2。

Fig 2 Profiles of mean concentration-time of ADM-CS-NPs or ADM-Sol via i.n.or i.v.administration in hippocampus of rats(±s，n=6)

3.3.3藥動學參數大鼠給予 ADM-Sol(i.n.)、ADM-Sol(i.v.)、ADM-CS-NPs(i.n.)、ADM-CSNPs(i.v.)后主要藥動學參數見 Tab 1，主要藥動學參數柱狀圖見Fig 3。

4 討論

納米粒的制備方法有多種。Cetin等［8］采用離子交聯法制備了bFGF殼聚糖納米粒，所得納米粒外觀形態、載藥量、包封率、粒徑分布等指標均良好。本實驗采用離子交聯法制得的ADM-CS-NPs表面光滑圓整，平均粒徑(98.80±0.70)nm、PDI(0.084±0.001)、包封率(78.37±1.52)%、載藥量(4.46±0.16)%，各項指標均符合納米粒鼻腔給藥的要求，說明采用離子交聯法制備鼻腔用ADM-CS-NPs切實可行。

大腦膠質瘤是顱內最常見的腫瘤，其病變范圍較廣泛，病變部位可以是海馬、額葉、顳葉、枕葉、頂葉、基底節等，而腦微透析探針埋植于海馬區是一種通用、可靠的方法，故本實驗采用腦微透析在海馬部位取樣技術［9］。

Tab 1 Brain pharmacokinetic parameters of ADM-CS-NPs or ADM-Sol via i.n.or i.v.administration(±s，n=6)

Tab 1 Brain pharmacokinetic parameters of ADM-CS-NPs or ADM-Sol via i.n.or i.v.administration(±s，n=6)

Parameters ADM-CS-NPs(i.n.)ADM-Sol(i.n.)ADM-CS-NPs(i.v.)ADM-Sol(i.v.)Tmax/min 300.00 ±26.12 20.00 ±2.91 180.00 ±19.11 20.00±2.00 Cmax/mg·L －1 93.00 ±8.53 90.00 ±7.31 19.11 ±1.91 10.70 ±0.96 AUC0→11h/mg·h·L －1 17809.05 ±650.24 4736.70 ±53.40 5159.97 ±120.59 312.68 ±4.99 MRT/min 390.49 ±6.87 73.43 ±2.37 281.53 ±4.9923.39 ±1.32

Fig 3Histogram of brain pharmacokinetic parameters of ADM-CS-NPs or ADM-Sol via i.n.or i.v.administration(±s，n=6)

由 Fig 2 及 Tab 1 可知，ADM-CS-NPs(i.n.)與ADM-CS-NPs(i.v.)、ADM-Sol(i.v.)、ADM-Sol(i.n.)相比，ADM-CS-NPs(i.n.)的Cmax值最高，AUC0→11h值最大，說明 ADM-CS-NPs(i.n.)吸收入腦的藥物量最多;Tmax值最大，表明ADM-CS-NPs(i.n.)起效最慢，具有緩釋作用;而MRT值最大，提示ADM-CS-NPs(i.n.)在腦內消除緩慢。

Fig 3(A)、(B)結果顯示，與靜脈給藥相比，鼻腔給藥可提高腦內ADM藥物濃度，有效實現腦內遞藥。ADM-Sol通過i.v.給藥，血液分布容積較大，暴露于血腦屏障的藥物量少，并且血腦屏障為靜注藥物入腦主要障礙［10］，故藥物吸收入腦緩慢且腦內遞藥量減少;ADM-Sol通過i.n.給藥，接觸到有效吸收部位(鼻黏膜)的藥物量多，且鼻腔具有獨特的生理結構，可通過嗅神經通路和嗅黏膜上皮通路使藥物直接繞過血腦屏障直接進入顱內，即鼻－腦通路發揮中樞治療作用，故經鼻腔給藥后腦內ADM濃度明顯高于靜脈給藥。ADM-CS-NPs通過鼻腔給藥的腦內遞藥量明顯高于靜脈注射給藥，其原因一方面可能是由于殼聚糖表面荷正電，可通過靜電作用與荷負電的鼻黏膜上皮組織結合，從而延長藥物在鼻黏膜組織的滯留時間，促進藥物在鼻腔的吸收。另一方面，載藥納米粒可能通過表面活性劑效應，緊密連接開放，胞吞作用，跨膜直接入腦，抑制外排泵作用等機制穿透血腦屏障［11－12］，從而提高ADM腦內濃度。Yue等［13］研究亦發現，經鼻腔給藥后，腦內的石杉堿甲AUC明顯高于經靜脈給藥。

Fig 3(C)、(D)結果顯示，ADM制成納米粒，可延長ADM在腦內有效濃度的持續時間，具有緩釋、長效作用。原因可能有:ADM通過化學或物理作用分散于納米粒內部或吸附于納米粒表面，其中吸附于表面的藥物釋放較快，而分散于載體材料CS中的藥物則需通過CS的小孔或隨著CS的降解緩慢釋放。Lee等［14］亦提出氧氟沙星制備成白蛋白微粒/納米粒后，腦內釋放超過48 h，具明顯的緩釋作用。

本實驗以CS為載體材料，制備ADM-CS-NPs，成功建立大鼠腦微透析海馬部位取樣技術，研究了納米粒和溶液劑兩種劑型經不同給藥途徑對ADM腦內藥動學的影響。結果顯示ADM-CS-NPs鼻腔給藥可以實現ADM腦內遞藥，并延長腦內有效藥物濃度的持續時間，發揮長效作用。

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