鞘內(nèi)西地那非能減輕神經(jīng)病理性疼痛大鼠的痛覺高敏

王洪超，李偉偉，李雪飛，許 倩，劉清珍，劉 健，李偉彥

(1.徐州醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)重點實驗室，江蘇徐州 221002;2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院麻醉科，江蘇 南京 210002)

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain)以痛覺高敏為主要特征，近年來大量研究提示由脊髓膠質(zhì)細胞介導(dǎo)過度的神經(jīng)炎癥是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生維持的一個重要機制［1］。隨著體外實驗發(fā)現(xiàn)提高膠質(zhì)細胞內(nèi)環(huán)磷腺苷(cyclic 3'，5'-adenosine monophosphate，cAMP)水平能抑制膠質(zhì)細胞的活化［2］，抑制膠質(zhì)細胞內(nèi)磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)成為治療神經(jīng)病理性疼痛的一個重要研究方向。

西地那非(sildenafil)是高度選擇性磷酸二酯酶5(PDE5)抑制劑，目前主要應(yīng)用于治療男性勃起功能障礙，既往研究已證實西地那非能抑制急性炎性疼痛，同時亦有研究證明PDE5抑制劑能夠抑制小膠質(zhì)細胞的激活［3］，但目前尚無西地那非用于神經(jīng)病理性疼痛的研究報道。本實驗采用大鼠L5脊神經(jīng)切斷神經(jīng)病理性疼痛模型，觀察鞘內(nèi)給予不同劑量西地那非對大鼠痛覺過敏的影響，并觀察其對小膠質(zhì)細胞的活化、促炎細胞因子TNF-α和 IL-1β表達的影響。

1 材料與方法

1.1動物和分組清潔級♂ SD大鼠120只(由南京軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗中心提供)，體質(zhì)量190～220 g，隨機分為5組，每組24只。Ⅰ組:假手術(shù)組;Ⅱ組:L5脊神經(jīng)切斷模型鞘內(nèi)注射20 μl生理鹽水;Ⅲ～Ⅴ組:L5脊神經(jīng)切斷模型分別鞘內(nèi)注射3 μg/20 μl、10 μg/20 μl、30 μg/20 μl 西地那非(China Pfizer)組;劑量選擇參考既往文獻［4］。

1.2左側(cè)L5脊神經(jīng)切斷模型參照Colburn等［5］方法，即在2%的戊巴比妥40 mg·kg-1麻醉后，切開大鼠左側(cè)L5至骶1棘突表面皮膚，分離椎旁肌肉，去除L5橫突，暴露L5脊神經(jīng)，Ⅱ～Ⅴ組用3-0絲線結(jié)扎并切斷L5脊神經(jīng)，Ⅰ組僅暴露神經(jīng)，不予結(jié)扎切斷處理。手術(shù)操作在14∶00至16∶00時完成。

1.3鞘內(nèi)給藥鞘內(nèi)注射參照 Mestre等［6］的方法。大鼠局部麻醉，用連有PE-10導(dǎo)管的稍鈍針頭經(jīng)L5和L6椎間隙行椎管穿刺，以穿刺針內(nèi)有腦脊液流出或動物出現(xiàn)突然地側(cè)向甩尾運動作為穿刺成功的標(biāo)志。鞘內(nèi)注射采用25 μl微量進樣器(上海高欣玻璃儀器廠)進行。術(shù)后d 7，行為學(xué)測試后，Ⅰ組和Ⅱ組鞘內(nèi)注射20 μl生理鹽水，Ⅲ～V組鞘內(nèi)注射相應(yīng)劑量的西地那非，給藥共持續(xù)5 d。操作在14∶00至16∶00時完成。

1.4行為學(xué)測試機械痛閾值(MWT)的測定，以機械測痛儀(Model 2390CE，ⅡTC Life Science.Inc，美國)測定。每只大鼠重復(fù)測量5次，間隔5 min，去除最大和最小值，計算3次的平均值即為大鼠的MWT值。行為學(xué)測試在安靜的24℃的動物房中進行，時間在8∶00至10∶00時完成。每組大鼠各取6只于術(shù)前1 d，術(shù)后7、8、10和12 d進行行為學(xué)測試。

1.5標(biāo)本采集于給藥后與術(shù)后8、10、12 d各組大鼠完成行為學(xué)測試后，每組于3個時間各取8只大鼠與腹腔注射戊巴比妥60 mg·kg-1處死，取脊髓-80℃凍存。

1.6L5脊髓細胞因子測定每組于3個時間點取L5脊髓(每組4只)，組織勻漿、離心取上清夜，按照試劑盒指示采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測定 TNF-α、IL-1β 含量。

1.7Real-time PCR檢測L5脊髓小膠質(zhì)細胞標(biāo)記物白細胞分化抗原11b(CD11b，cluster of differentiation antigen 11b)① RNA的提取，每組于3個時間點取L5脊髓(每組4只)采用TRIzo1(15596-026，Invitrogen，America)試劑盒提取總核糖核酸(Ribonucleicacid，RNA)。② cDNA的合成，引物由南京金斯瑞科技有限公司合成。運用cDNA第一鏈合成試劑盒(PC0002，F(xiàn)ermentas，Lithuania)在逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV)作用下反轉(zhuǎn)錄合成為反向轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸 (complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)。③ 實時定量PCR擴增，取25 μl反應(yīng)體系以梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)模板作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，在 Rotor-Gene 3000 Realtime PCR儀中擴增。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，以SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理。各組測定指標(biāo)組間比較采用雙因素方差分析，組內(nèi)比較采用重復(fù)測量單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1行為學(xué)結(jié)果各組大鼠術(shù)前1 d的MWT差異無顯著性;與Ⅰ組比較，術(shù)后d 7，其它4組MWT均明顯降低(P＜0.05);與Ⅱ組比較，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組術(shù)后8、10、12 d MWT 有明顯升高(P＜0.05)，且 MWT 的增高與西地那非劑量相關(guān)(Fig 1)。

Fig 1 Comparison of mechanical withdrawl threshold among the five groups of rats(±s，n=6)

2.2L5脊髓細胞因子TNF-α和IL-1β表達測定與Ⅰ相比較，其余各組大鼠術(shù)后8、10、12 d TNF-α和IL-1β的水平均明顯上升(P＜0.05)。與Ⅱ相比較，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組大鼠鞘內(nèi)注射西地那非術(shù)后8、10、12 d能劑量依賴地降低脊髓TNF-α和IL-1β的含量(Tab 1、2)。

Tab 1 Levels of TNF-α in the spinal cord of L5segment after intrathecal injection of sildenafil(ng·g-1，±s，n=4)

Tab 1 Levels of TNF-α in the spinal cord of L5segment after intrathecal injection of sildenafil(ng·g-1，±s，n=4)

#P ＜0.05 vs groupⅠ;*P＜0.05 vs groupⅡ

Group On post-surgical 8 d 10 d 12 dⅠ13.08 ±3.3* 14.29 ±4.43* 14.47 ±4.1*39.31 ±1.1# 60.23 ±2.73# 116.53 ±8.12#Ⅲ19.22 ±4.22#* 33.65 ±6.51#* 79.61 ±2.61#*Ⅳ19.14 ±1.93#* 29.95 ±6.15#* 57.91 ±9.71#*Ⅴ10.23 ±4.17* 21.15 ±7.14* 35.25 ±2.43#*Ⅱ

Tab 2 Levels of IL-1β in the spinal cord of L5segment after intrathecal injection of sildenafil(ng·g-1，±s，n=4)

Tab 2 Levels of IL-1β in the spinal cord of L5segment after intrathecal injection of sildenafil(ng·g-1，±s，n=4)

#P ＜0.05 vs groupⅠ;*P＜0.05 vs groupⅡ

8 d 10 d 12 dⅠGroup On post-surgical 29.52 ±9.53* 29.1 ±5.99* 34.88 ±3.35*Ⅱ 147.42 ±20.86# 220.0 ±8.65# 307.17 ±23.94#Ⅲ 118.15 ±5.84#* 143.86 ±2.88#* 205.2 ±14.47#*Ⅳ97.38 ±9.01#* 123.76 ±4.59#* 152.0 ±14.7#*Ⅴ35.6 ±19.47* 74.89 ±17.37#* 60.59 ±13.67*

2.3PCR檢測L5CD11b的表達與Ⅰ組相比較，Ⅱ、Ⅲ組大鼠術(shù)后各天CD11b表達增多(P＜0.05)，說明在小膠質(zhì)細胞在術(shù)后8、10、12 d激活增加，而Ⅳ組術(shù)后12 d后以及Ⅴ組術(shù)后各天CD11b表達降至正常(P＞0.05)。與Ⅱ組相比較，Ⅲ～Ⅴ組大鼠鞘內(nèi)注射西地那非后在術(shù)后8、10、12 d CD11b表達降低(P＜0.05)，見 Tab 3。

Tab 3 Expression of CD11b mRNA in the spinal cord of L5 segment after intrathecal injection of sildenafil(±s，n=4)

Tab 3 Expression of CD11b mRNA in the spinal cord of L5 segment after intrathecal injection of sildenafil(±s，n=4)

#P ＜0.05 vs groupⅠ;*P＜0.05 vs groupⅡ

Group On post-surgical 8 d 10 d 12 dⅠ3.54 ±0.5* 3.61 ±0.52* 3.75 ±0.72*11.50 ±2.04# 12.74 ±1.92# 14.87 ±3.06#Ⅲ8.92 ±1.74#* 9.98 ±1.59#* 7.26 ±0.94#*Ⅳ7.15 ±0.16#* 6.6 ±0.76#* 6.54 ±0.89*Ⅴ5.69 ±1.49* 4.85 ±0.79* 4.51 ±1.74Ⅱ*

3 討論

近年來，越來越多的研究證實膠質(zhì)細胞為主導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)免疫反應(yīng)在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生、維持中發(fā)揮重要作用，因此調(diào)控膠質(zhì)細胞功能，控制過度的神經(jīng)炎癥成為目前神經(jīng)病理性疼痛研究及藥物開發(fā)的一個熱點［1］，神經(jīng)損傷后脊髓前角和后角的小膠質(zhì)細胞迅速活化增殖，大約在4 d達頂峰，數(shù)周緩慢下降，并能分泌多種炎癥因子如:TNF-α、IL-1β、IL-6、前列腺素等，可直接活化初級傳入神經(jīng)元中樞支和脊髓后角神經(jīng)元。己酮可可堿(pentoxifylline)、丙戊茶堿(propentofylline)及異丁地特(ibudilast)可抑制cAMP的降解，但均為非特異性PDE抑制劑，它們可以抑制PDE3、4等多種亞型，并且抑制小膠質(zhì)細胞或者星形膠質(zhì)細胞激活，預(yù)防或治療神經(jīng)病理性疼痛［7-9］。

西地那非是高度選擇性PDE5抑制劑，能特異性抑制cGMP的降解，從而提高細胞內(nèi)cGMP含量。目前已證實西地那非在糖尿病疼痛模型、角叉菜膠實驗、扭體實驗、福爾馬林實驗中發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用［10-13］，但其鎮(zhèn)痛作用機制目前尚未明確，NO-cGMP信號通路、脊髓水平的腺苷受體和血清素受體［4］、NO-cGMP 相關(guān)的鉀離子通道［14］，GABA 受體［15］和阿片類受體［16］都可能與西地那非的鎮(zhèn)痛作用有關(guān)。此外最近研究證明西地那非能夠明顯抑制LPS激活的體外培養(yǎng)的N9小膠質(zhì)細胞分泌的細胞因子 IL-1β 和 TNF-α［3］，提示抑制脊髓小膠質(zhì)細胞活性，也可能是西地那非鎮(zhèn)痛作用的一個機制。

本實驗選擇L5脊神經(jīng)結(jié)扎切斷模型，該模型較穩(wěn)定，術(shù)后7 d后大鼠痛覺過敏處于穩(wěn)定狀態(tài)。我們發(fā)現(xiàn)，術(shù)后7 d開始連續(xù)鞘內(nèi)給予西地那非3、10和30 μg 5 d后能劑量依賴性的緩解大鼠神經(jīng)病理性疼痛，本實驗所用劑量已證實能抑制大鼠急性炎性疼痛［4］。此外，西地那非治療組的大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞標(biāo)記物CD11b的mRNA表達量劑量依賴地明顯下降，這提示西地那非能劑量依賴地抑制神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓的小膠質(zhì)細胞的活性，同時L5脊髓節(jié)段的促炎細胞因子TNF-α、IL-1β也明顯下降，這可能與膠質(zhì)細胞活性抑制有關(guān)。本研究未探討西地那非抑制小膠質(zhì)細胞的活性的分子機制，既往研究提示西地那非可能是通過升高小膠質(zhì)細胞細胞內(nèi)cGMP，抑制NF-κB和MAPKs信號通路的激活［3］，繼而抑制小膠質(zhì)細胞活化，減少促炎細胞因子的釋放。

綜上所述，我們的實驗證明了鞘內(nèi)給予西地那非能劑量依賴地緩解L5脊神經(jīng)切斷大鼠的痛覺高敏行為，該效應(yīng)可能與其劑量依賴地抑制脊髓小膠質(zhì)細胞活化，減少促炎細胞因子TNF-α、IL-1β釋放有關(guān)。本研究為下一步深入理解PDE抑制劑在膠質(zhì)細胞靶向調(diào)控治療中的作用機制提供了新的思路和理論依據(jù)，并為新型鎮(zhèn)痛藥物的研發(fā)提供新的方向。

［1］Scholz J，Woolf C J.The neuropathic pain triad:neurons，immune cells and glia［J］.Nat Neurosci，2007，10(11):1361-8.

［2］Yoshikawa M，Suzumura A，Tamaru T，et al.Effects of phosphodiesterase inhibitors on cytokine production by microglia［J］.Mult Scler，1999，5(2):126-33.

［3］Zhao S Q，Zhang L J，Lian G N，et al.Sildenafil attenuates LPS-induced pro-inflammatory responses through down-regulation of intracellular ROS-related MAPK/NF-κB signaling pathways in N9 microglia［J］.Int Immunopharmacol，2011，11(4):468-74.

［4］Lee H G，Kim W M，Park C H，et al.Roles of adenosine and serotonin receptors on the antinociception of sildenafil in the spinal cord of rats［J］.Yonsei Med J，2010，51(6):960-4.

［5］Colburn R W，Rickman A J，DeLeo J A.The effect of site and type of nerve injury on spinal glial activation and neuropathic pain behavior［J］.Exp Neural，1999，157(2):289-304.

［6］Mestre C，Pelissier T，F(xiàn)ialip J，et al.A method to perform direct transcutaneous intrathecal injection in rats［J］.J Pharmacol Toxicol Methods，1994，32(4):197-200.

［7］張艷兵，王麗娜，成 浩，等.丙戊茶堿預(yù)處理削弱大鼠關(guān)節(jié)炎痛覺過敏的脊髓機制［J］.中國藥理學(xué)通報，2007，23(10):1384-8.

［7］Zhang Y B，Wang L N，Cheng H，et al.Effect and mechanism of pretreating propentofylline on attenuation of arthritis thermal hyperalgesia［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(10):1384-8.

［8］Ledeboer A，Liu T，Shumilla J A，et al.The glial modulatory drug AV411 attenuates mechanical allodynia in rat models of neuropathic pain［J］.Neuron Glia Biol，2006，2(4):279-91.

［9］Liu J，Li W，Zhu J，et al.The effect of pentoxifylline on existing hypersensitivity in a rat model of neuropathy［J］.Anesth Analg，2008，106(2):650-3.

［10］Jain N K，Patil C S，Singh A，Kulkarni S K.Sildenafil，a phosphodiesterase-5 inhibitor，enhances the antinociceptive effect of morphine［J］.Pharmacology，2003，67(3):150-6.

［11］Araiza-Salda?a C I，Reyes-García G，Bermúdez-Oca?a D Y，et al.Effect of diabetes on the mechanisms of intrathecal antinociception of sildenafil in rats［J］.Eur J Pharmacol，2005，527(1-3):60-70.

［12］Yoon M H，Park K D，Lee H G，et al.Additive antinociception between intrathecal sildenafil and morphine in the rat formalin test［J］.J Korean Med Sci，2008，23(6):1033-8.

［13］Yoon M H，Kim C M，Lee H G，et al.Synergistic antinociception of intrathecal sildenafil with clonidine in the rat formalin test［J］.Pharmacol Biochem Behav，2009，92(4):583-8.

［14］Vale M L，Rolim D E，Cavalcante I F，et al.Role of NO/cGMP/KATPpathway in antinociceptive effect of sildenafil in zymosan writhing response in mice［J］.Inflamm Res，2007，56(2):83-8.

［15］Huang L J，Yoon M H，Choi J I，et al.Effect of sildenafil on neuropathic pain and hemodynamics in rats［J］.Yonsei Med J，2010，51(1):82-7.

［16］Yoon M H，Kim W M，Lee H G，et al.Roles of opioid receptor subtypes on the antinociceptive effect of intrathecal sildenafil in the formalin test of rats［J］.Neurosci Lett，2008，441(1):125-8.