全局調控基因對抗生素生物合成的影響

陳艷萍，趙春田，裘娟萍

(浙江工業大學 生物與環境工程學院，浙江 杭州 310014)

鏈霉菌是一類具有分枝狀菌絲體的好氧性革蘭氏陽性細菌，它們具有復雜的形態分化和次級代謝過程，能產生多種類型的具有重要應用價值的次級代謝產物。例如，用于抗家畜寄生蟲及殺螨蟲的阿維菌素 (avermectin)，防治西紅柿青枯病的鏈霉素(streptomycin)，用于獸藥的四環素 (tetracycline)，用于飼料添加劑的默諾霉素 (moenomycin)等。隨著人們對藥物需求的日益增加，鏈霉菌生產抗生素的研究也突顯其重要性。在這些抗生素合成過程中存在龐大而復雜的調控系統:途徑特異性調控因子主要參與特定的抗生素的生物合成過程;全局多效調控因子不僅調控多種抗生素的產生，還參與鏈霉菌的形態分化。

全局性調控基因一般位于抗生素生物合成基因簇之外，調控相應途徑特異性基因的表達。相對于鏈霉菌次級代謝中的其他調控模式而言，全局調控是一種更為多樣、普遍、復雜的調控模式。全局調控基因可以調控多條次級代謝途徑，對磷酸鹽或者氮源匱乏、細胞壁損壞、熱休克、pH壓力等環境和營養脅迫信號做出反應［1-2］。根據參與調控的基因的數量通常可以將全局調控基因分為孤立響應調控 (orphan response regulate)基因和雙組分調控系統 (two-component systems，TCSs)基因。本文以鏈霉菌模式生物天藍色鏈霉菌 (Streptomyces coelicolor)的全局調控基因為參考，就近年來鏈霉菌中抗生素生物合成全局調控的研究進展進行綜述，為利用基因工程手段提高抗生素的產量或對其進行結構改造提供依據。

1 孤立響應調控基因

孤立響應調控基因通常為單個基因，調控抗生素的生物合成。目前所發現的孤立響應基因眾多，本文主要對以下幾種研究得比較清楚的孤立響應調控基因作詳細介紹 (表1)。

1.1 atrA

2005年，Uguru 等［3］在 S.coelicolor A3(2)中發現一種新的TetR家族的ActⅡ-ORF4的激活因子，命名為atrA(actinorhodin-associated transcriptional regulator)。Hong 等［4］通過體外實驗發現，atrA不僅可結合到 actⅡ-orf4的啟動子區，還可結合到灰色鏈霉菌 (Streptomyces griseus)途徑特異性調控基因 strR的啟動子，將 atrA導入 S.griseus后可引起鏈霉素產量下降。Hirano等［5］發現S.griseus中atrA基因表達的AtrA蛋白在某些特定的培養條件下對鏈霉素的生物合成起正調控作用。最近，Chen等［6］在對阿維菌素的代謝途徑進行研究時發現，其基因組上也存在單拷貝的atrA同源基因aveI，該基因被阻斷后，阿維菌素的主要組分Bla的產量升高，而在 aveI的回復突變株中，Bla的產量與野生菌相比又明顯下降，表明aveI對阿維菌素的生物合成起負調控作用;將aveI多拷貝質粒導入 S.coelicolor中，放線紫紅素 (actinorhodin，Act)產量明顯增加，說明 aveI對 S.coelicolor中Act的生物合成起正調控作用。李光偉等［7］在力達霉素 (lidamycin)產生菌球孢鏈霉菌 (Streptomyces globisporus)C-1027中克隆到atrA同源基因。綜上所述，atrA因菌株培養條件不同或屬間差異對抗生素的合成起正調控或負調控作用。

表1 鏈霉菌孤立調控基因及其功能

1.2 bldA

bldA基因又稱“光禿”基因，是目前研究最透徹的形態分化調控基因之一，編碼鏈霉菌基因組中唯一能有效識別稀有TTA密碼的tRNA。bldA阻斷突變菌株不能形成氣生菌絲和孢子，而表現為“光禿”表型［8］，“光禿”基因的名字也由此得來。測序完成的S.coelicolor基因組顯示，其中145個含有TTA密碼子的基因作為bldA潛在靶基因，構成了由bldA控制的龐大而復雜的基因調控元，因此鏈霉菌中，bldA基因在多水平級聯調控系統中發揮著重要作用。S.coelicolor Act生物合成途徑中，bldA通過控制含TTA密碼子的途徑特異性調控基因actⅡ-orf4和抗生素產物輸出調控基因 actⅡ-orf2的表達來調節抗生素合成［9］。依賴 bldA調控抗生素合成的現象在其他鏈霉菌中也普遍存在，如白黑鏈霉菌 (Streptomyces alboniger)、S.griseus和變鉛青鏈霉菌 (Streptomyces lividans)也都存在bldA通過控制含TTA密碼子基因表達來調節孢子產生和抗生素合成［10-11］。陶韋新等［12］通過阻斷阿維鏈霉菌 (S.avermitilis)NRRL 8165中 bldA基因，發現突變株喪失合成阿維菌素的能力，提示阿維菌素的合成受bldA調控;由于阿維菌素生物合成基因簇中aveA3和aveR含有TTA密碼子，推斷其翻譯可能受bldA的調控。

1.3 nsdA和nsdB

nsdA (negative regulator of streptomyces differenti-ation)基因是最早在 S.coelicolor中發現的一個全局性調控基因，含有三十四肽重復單位(tetratrico peptide repeat，TPR)結構，對其產孢、形態分化、抗生素的合成均有負調控作用。余貞等［13］進一步的研究發現，nsdA是保守存在于多種鏈霉菌中的全局性負調控基因，對鏈霉菌形態分化和抗生素的合成均具有負調節作用，阻斷nsdA基因可大大提高抗生素產量。例如，S.coelicolor A3(2)中nsdA基因的阻斷，引起Act、鈣依賴性抗生素 (calcium-dependent antibiotic，CDA)和次甲霉素 (methylenomycin，Mmy)超量產生，且產孢量也是野生型的2倍;S.avermitilis NRRL 8165中，nsdA基因的阻斷導致阿維菌素的產量提高了3～5倍;井岡霉素 (validamycin)產生菌吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)5008、鹽霉素(salinomycin)產生菌白色鏈霉菌 (Streptomyces albus)和慶豐霉素 (qingfengmycin)產生菌慶豐鏈霉菌 (Streptomyces qingfengmyceticus)等多種鏈霉菌中也發現有nsdA同源基因;陳芬等［14］阻斷肉桂地鏈霉菌 (Streptomyces cinnamoncnsis)中的nsdA基因后，莫能菌素 (monensin)的產量提高了2.7倍。郭鎖蓮等［15］等通過基因阻斷冰城鏈霉菌(Streptomyces bingchenggensis)226541中的nsdA基因，發現米爾貝霉素 (milbemycins)和南昌霉素(nanchangmycin)的產量分別提高了1.5和9倍。nsdA的廣泛存在為抗生素生產菌高產菌株的構建提供了新的靶標。

研究發現，同樣來自于 S.coelicolor的 nsdB(SCO7252)也編碼TPR結構的蛋白，阻斷nsdB基因使菌株的Act和CDA產量均提高，但形態分化沒有明顯變化［16］。含有 TPR結構域蛋白的具體作用機制還不清楚，該蛋白是如何表達、如何影響別的基因以致最終影響到形態分化和次級代謝的，這些問題都尚未闡明，或許是一種影響鏈霉菌分化的新模式。

1.4 relA

在某些重要的營養成分缺乏 (如氨基酸)時，細菌對某些基因和酶的表達進行嚴謹控制，稱為嚴謹反應 (stringent response)。嚴謹反應是細菌適應不利環境的一種調控方式。許多研究發現，嚴謹反應依賴于焦磷酸鳥苷酸 (p)ppGpp的瞬時增加，當空載的tRNA結合到核糖體的A位點時，四磷酸鳥苷酸合成酶基因relA編碼的蛋白催化 (p)ppGpp合成，(p)ppGpp的合成增加激活抗生素的合成。在大腸桿菌 (Escherichia coli)中人們發現(p)ppGpp能夠改變RNA聚合酶對σ因子的選擇性，這說明了 (p)ppGpp調控的靶點是 RNA聚合酶。當RNA聚合酶β亞基利福平 (rifampicin)結合域上某個位點突變后， (p)ppGpp對抗生素合成的直接調控作用消失了，提示這個位點可能靠近或者就是 (p)ppGpp結合RNA聚合酶的位點［17］，(p)ppGpp結合RNA聚合酶后，使后者的構象改變利于抗生素合成基因簇的轉錄［18］。在鏈霉菌中，relA的敲除表現為氮源缺陷條件下抗生素合成的缺陷，研究也證實了 S.coelicolor中relA敲除突變株中抗生素合成基因轉錄水平下降，以及抗生素合成途徑特異性調控基因actⅡ-orf4和redD的轉錄明顯下調［19］。Gomez-Escribano 等［20］研究發現，阻斷棒狀鏈霉菌 (Streptomyces clavuligerus)relA基因，使其不能形成氣生菌絲且不能產生孢子，克拉維酸 (clavulanic acid)和頭霉素 C(cephamycinC)的產量顯著增加。最近，Makitrynskyy等［21］將 S.coelicolor中 relA 基因導入加納鏈霉菌 (Streptomyces ghanaensis)ATCC 14672中異源過量表達，發現默諾霉素產量增加了2倍。

1.5 rrdA

rrdA(regulator of redD)基因編碼TetR家族蛋白，在 S.coelicolor中被發現，隨后依次在 S.avermitilis、產二素鏈霉菌 (Streptomyces ambofaciens)ATCC 23877等鏈霉菌中發現有同源基因。S.coelicolor rrdA阻斷突變株顯示 Red產量增加而 Act產量降低，將 rrdA多拷貝質粒導入 S.coelicolor中過量表達導致Red產量大大降低而Act高產;反轉錄PCR顯示RrdA通過阻遏redD mRNA的合成負調控Red的生物合成，但Act途徑特異性調控基因actⅡ-orf4的轉錄水平沒有發生變化，說明RrdA對Act在轉錄水平上沒有起正調控作用，可能通過與Act和Red合成途徑的共同前體競爭調控 Act的生物合成［22］。

1.6 sig6

鏈霉菌中的ECFσ因子能快速、準確地調控不同的壓力應答調控子以適應復雜的環境。目前，僅有一部分ECFσ因子因其在形態分化和次級代謝的調控作用而被廣泛關注［23-25］。sig6(SAV663)存在于 S.avermitilis中，編碼 RNA聚合酶 ECFσ因子，敲除該基因后，阿維菌素的產量增加了2.0～2.7倍，但對S.avermitilis的生長和形態無明顯影響;將含多拷貝sig6基因的質粒導入S.avermitilis野生菌株后，阿維菌素的產量降低。說明Sig6對S.avermitilis的阿維菌素起負調控作用［26］。RT-PCR分析證明，Sig6通過途徑特異性調控基因aveR調控阿維菌素的生物合成，這為通過改變ECFσ因子的活力增加鏈霉菌抗生素的產量開辟途徑。

1.7 ssgA

ssgA(sporulation-specific cell division)基因在S.coelicolor中過量表達導致 Red產量增加2～5倍，但Act的生物合成完全受阻［27］。S.coelicolor中Red生成的時間比 Act早，ssgA將 S.coelicolor的生理狀態控制在Red生成期，阻止其進入Act生成期。因此，ssgA可能代表另外一種協調抗生素生物合成與營養生長的新的重要模式［28］。由于ssgA對一些抗生素生物合成的正調控作用，現被應用于工業生產菌株上，如van Wezel等［29］通過過量表達S.lividans中 ssgA基因，導致其次級代謝產物產量增加2.5倍，S.coelicolor中 ssgA過量表達導致Red產量增加近10倍。因此，ssgA的過量表達為抗生素高產菌株的構建提供一種有效途徑。

1.8 wblA

wblA(WhiB-like transcription factor)基因首先于S.coelicolor中被發現，編碼 WhiB家族蛋白的同源物。其過量表達抑制 Act、Red和 CDA的合成，且不能產生孢子［30-31］。Noh 等［32］利用種間DNA微矩陣分析 (Interspecies DNA Microarray Analysis)發現波賽鏈霉菌 (Streptomyces peucetius)中也存在 wblA基因 (wblAspe)。阻斷 wblAspe導致阿霉素 (doxorubicin)道諾霉素 (doxorubucin)產量增加7倍。Rabyk等［33］在已測序的 S.ghanaensis中鑒定了 wblAgh基因，阻斷該基因發現 S.ghanaensis氣生菌絲不能產生孢子，且默諾霉素的產量增加了2.3倍，說明S.ghanaensis中的wblAgh基因和wblAsco、wblAspe一樣，負調控抗生素的生物合成，且與形態分化有關。

2 雙組分調控基因

在鏈霉菌中，雙組分調控系統是一類非常重要的全局調控系統，參與胞內滲透壓調節、新陳代謝、細胞生長及形態分化等多種生理代謝過程，尤其與鏈霉菌復雜的形態分化和抗生素合成的調控有著密切的關系。本文就以下4種雙組分調控系統基因作詳細介紹 (表2)。

表2 鏈霉菌中雙組分調控系統基因及其功能

2.1 absA1-absA2

AbsA1-AbsA2(SCO3225-SCO3226)是S.coelicolor中研究得最為清楚的一對雙組分調控系統。absA1-absA2基因位于鈣依賴性抗生素(CDA)生物合成基因簇內部，敲除S.coelicolor中absA1和absA2基因，證明了AbsA雙組分系統負調控Act、Red和CDA的合成［34］。轉錄分析顯示，AbsA1-AbsA2主要是通過影響途徑特異性調控基因actⅡ-orf4和redD的轉錄來調控Act和Red的合成。而對于CDA生物合成的調控，是通過調控與CDA生物合成相關的多肽合成酶的表達來實現。AbsA1感應外界環境變化并轉為激酶形式，對自身保守的組氨酸殘基磷酸化進行自體激活，然后將自身的磷酸基團轉移到應答調節子AbsA2保守的天冬氨酸殘基上，磷酸化的應答調節子AbsA2再有力地結合到DNA的結合位點調控轉錄。當外界信號消失或被降解，AbsA抑制被解除，AbsA1轉變為磷酸酶形式，將AbsA2去磷酸化，抗生素合成基因表達［35］。將absA1的等位基因導入Streptomyces flavopersicus異源表達發現，抗菌類物質粉霉素(pulvomycin)的沉默基因被激活［36］。因此，AbsA雙組分調控系統的多效調控被廣泛應用于開發新的抗菌物質。

2.2 afsR-afsK

AfsR屬于STAND家族蛋白，由afsR基因編碼，N端有OmpR家族的兩個特征結構域 (DNA結合結構域和轉錄激活結構域)，同時還含有結合ATP的保守motif，在其C端有TPR結構域。通過磷酸化信號轉導作用，AfsR可以同時對多種抗生素的合成進行調控。AfsK與細胞膜連接，感應外界特定的環境信號，將自身蘇氨酸和絲氨酸殘基磷酸化，以增加其激酶活力［37］。細胞膜上被激活的AfsK催化磷酸化細胞質中AfsR的蘇氨酸殘基和絲氨酸殘基，極大地增強了AfsR與DNA的結合能力［38］。AfsR-P結合到位于 afsR下游 afsS的啟動子-35區域并激活它的轉錄，afsS編碼由63個氨基酸組成的蛋白AfsS，以未知方式正調控途徑特異性基因actⅡ-orf4、redD和cdaR，從而增加 Act、Red和CDA的產量［39-40］。afsR基因失活突變導致 S.coelicolor中 Act、CDA的產量明顯下降，導入 S.lividans中能促進原本沉默的Act和Red的合成［41］。AfsK磷酸化AfsR的能力由afsK上游基因的編碼產物KbpA調節，當KbpA與AfsK結合時，AfsK的激酶活力被抑制并阻止AfsR的磷酸化［42］。

在S.peucetius中也發現了AfsR的結構類似物AfsR-p，當其克隆到外源質粒上ermE啟動子下游并導入S. peucetius、 S. lividans TK24、 S.clavuligerus、S.griseus表達時，相應的道諾霉素、Act、克拉維酸、鏈霉素分別提高了4倍、2.6倍、1.5 倍和略有提高［43］。

afsS啟動子區是AfsR的結合位點，該位點同時又是一個潛在的 PHO box。凝膠遷移實驗(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)和DNA足跡實驗 (DNA footprinting assay)的結果驗證了PhoP和AfsR在afsS基因啟動子區的識別序列是重合的;體外結合試驗證明了PhoP和AfsR競爭性結合afsS啟動子區，AfsR同時能夠結合PhoP調控的基因，如pstS和phoR/phoP的啟動子區;報告基因 luxAB實驗證實 PhoP可下調 afsS的表達，AfsR可下調 pstS和 phoR/phoP的表達［44］。這表明PhoP和AfsR這兩個全局調控因子之間存在復雜的相互交叉作用。

2.3 cutS-cutR

CutS-CutR(SCO5863-SCO5862)是鏈霉菌中第1個被鑒定的雙組分調控系統［45］。迄今為止，多種鏈霉菌中均有報道該雙組分調控系統的存在。插入突變實驗顯示，CutR-CutS的基因阻斷會引起S.lividans抗生素Act的過量生成;而當CutR-CutS在S.coelicolor中過量表達時，Act的生物合成明顯被抑制，因此與AbsA1-AbsA2一樣，CutR-CutS對抗生素Act的生物合成也起負調控作用［46］。

2.4 phoR-phoP

磷酸鹽是活細胞的重要組成成分，其重要作用及其在自然界中的缺乏使得細菌進化出多種應對磷酸鹽缺乏的機制，這些機制導致細菌能夠適應貧磷酸鹽的環境。能夠響應磷酸鹽濃度變化的蛋白共同組成一個家族，稱為 Pho調控子 (phosphate regulon)，PhoR-PhoP及其所調控基因編碼的產物均屬于PHO調控子家族［47］。該調控子家族成員的序列具有共同特征，即在其啟動子區有一個PHO box序列。低磷酸鹽濃度一直被認為能夠刺激抗生素和其他次級代謝物的產生，包括了鏈霉素、四環素等［48］。在 E.coli中低磷酸鹽濃度傳遞的信號首先使得感應器激酶 (PhoR)自我磷酸化，然后PhoR又將這個磷酸基團傳遞到相應調控蛋白(PhoP)的一個N端天冬氨酸殘基上，導致PhoP與其調控基因啟動子的結合能力大大提高，增強了這些基因的轉錄表達，PhoP的結合位點一般就是PHO box序列。在S.lividans中敲除 PhoR-PhoP雙組分系統基因的突變株表現出堿性磷酸酶 (AP)活性的降低和磷酸鹽轉運的減少，同時Act和Red的大量產生，且無論在高磷酸鹽還是低磷酸鹽情況下產生Act和Red的能力均高于野生型菌株，說明PhoR-PhoP雙組分系統抑制了抗生素的產生［49］。

2.5 rapA1-rapA2

2007年，Lu等［50］在 S.coelicolor中發現了一新的TCS，命名為RapA1-RapA2(regulation of both actinorhodin and a typeⅠ polyketide)，調控 Act和Ⅰ型聚酮化合物的生物合成。敲除rapA1-rapA2基因后，其生長和形態與野生菌株M145相比沒有差異，但是Act和Ⅰ型聚酮化合物的產量明顯降低。其作用模式與absA1-absA2類似，通過影響途徑特異性調控基因actⅡ-orf4和kasO的轉錄來調控Act和Ⅰ型聚酮化合物的合成，但其對Act和Ⅰ型聚酮化合物的調控可能代表 S.coelicolor中一種新的調控途徑。

2.6 abrA1-abrA2

2011年，Yepes等［51］在 S.coelicolor M145 中發現一種新的雙組分調控基因 abrA1-abrA2(antibiotic rugulator)，敲除該基因后，Act、Red和CDA的產量高于野生型菌株，且不產孢子，說明abrA1-abrA2負調控抗生素的生物合成和形態分化。

3 小結與展望

鏈霉菌抗生素生物合成全局調控的顯著特點之一就是它的多樣性和復雜性。不同的基因應答不同的環境、生理信號和一系列信號轉導系統介導的外界壓力。全局調控基因多效調控多種抗生素的生物合成，大部分是以層層級聯的方式間接調控，只有AbsA1-AbsA2和rapA1-rapA2等少數效應因子直接作用于抗生素合成途徑中的途徑特異性調控基因。不同調控基因之間也存在著交叉作用，導致抗生素生物合成的調控網絡更為復雜。要將復雜的調控網絡研究透徹是一個巨大的工程。目前，全基因組測序、全基因組微距陣、蛋白質組學和基因表達的時間-空間分析的發展，為理清調控網絡的復雜關系提供了有效的手段。

加強對農用抗生素生物合成全局調控的研究，將加速構建新農藥產生菌或抗生素高產菌株的研究過程。默諾霉素作為動物生長促進劑而廣泛應用于飼料添加劑，作者以relA和nsdA基因為研究對象，利用基因工程手段阻斷這兩個基因的編碼，研究其對斑伯鏈霉菌 (Streptomyces bambergiensis)和加納鏈霉菌 (Streptomyces ghanaensis)中默諾霉素的產量及形態分化的影響，為進一步闡明次級代謝和形態分化調控網絡奠定一定基礎。

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