桑黃多糖抗疲勞及耐缺氧實驗研究

郭俊平，趙述淼，馬姝萍，梁運祥*

（華中農業大學生命科學技術學院/農業微生物學國家重點實驗室，湖北 武漢 430070）

桑黃 (Phellinus linzeus)又名桑臣、桑耳、桑黃菇等。分類學上屬擔子菌亞門、層菌綱、多孔菌目、多孔菌科、針層孔菌屬，是大型珍稀藥用真菌[1]。桑黃含有多種化學成分，其最主要的活性成分是多糖。近年來，許多真菌研究者致力于桑黃抗腫瘤活性的研究，而對桑黃多糖的抗疲勞和耐缺氧活性研究甚少[2－3]。因此，對人工培養桑黃中的多糖進行生物活性研究，對開發利用我國珍稀藥用真菌資源具有重要的學術意義，并且對桑黃天然藥物和保健品的開發也具有一定的應用價值。

本研究將從灌胃小鼠抗疲勞和耐缺氧作用兩方面，探討桑黃多糖對改善機體體質的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

緩解體力疲勞功能檢測程序和方法見 《保健食品檢驗與評價技術規范 （2003版）》，主要采用負重游泳實驗，進行血清尿素氮測定、肝糖元測定、和血乳酸測定；其負重游泳實驗結果陽性，且血乳酸、血清尿素、肝糖原3項生化指標中任2項指標陽性，可判定該受試樣品具有緩解體力疲勞功能的作用[4]。

提高缺氧耐受力功能檢測程序和方法見 《保健食品功能學評價程序與檢驗方法規范》 (2003版)。通過常壓耐缺氧、亞硝酸鈉中毒、急性腦缺血性缺氧3個動物實驗來認定"耐缺氧"的保健功能。如果3項實驗中任意兩項實驗顯示為陽性，就說明該產品有提高缺氧耐受性的保健功能[4－5]。本文選擇常壓耐缺氧實驗和亞硝酸鈉中毒存活實驗。

1.1.1 實驗菌種

實驗菌株為桑黃 （P.linzeus），由華中農業大學菌種保藏中心提供。

1.1.2 實驗動物

實驗動物為雄性KM小鼠，300只，體重約20 g～23 g來自湖北省疾病控制中心，許可證號：SCXK(鄂)2008－0005。

1.1.3 試劑

肝糖原、血乳酸、血清尿素氮測定試劑盒 （購買于南京建成生物工程公司）、鈉石灰 （上海五四化學試劑有限公司），亞硝酸鈉、苯酚、硫酸、乙醇及其他試劑均為分析純 （國藥集團化學有限公司）。

1.2 儀器與設備

DU800分光光度計 (美國 BECKMAN COULTER公司)；5810R臺式高速冷凍離心機 （德國艾本德公司）；AR1530分析天平 （美國奧豪斯公司）；HQL150C恒溫搖床 （武漢中科科儀有限公司）；GHP－9270恒溫培養箱 （上海索譜儀器有限公司）；SHB－Ⅲ循環水式多用真空泵 （鄭州長城科工貿有限公司）；計時秒表；鉛皮。

1.3 實驗方法

1.3.1 桑黃多糖的提取

桑黃菌種經發酵篩分得到的菌絲體，料水比為1∶70，90℃水浴浸提3 h，抽濾，取濾液，加入適量的α－淀粉酶，60℃酶解1 h后，濃縮至所需體積，再向濃縮液中加入無水乙醇，混勻，使乙醇終濃度為60%，置于4℃冰箱中， 醇沉 12 h后， 5 000 r·min－1離心 20 min， 棄去上清，取沉淀，用80%的乙醇洗滌3次～4次，于60℃烘干，即得多糖樣品。用50 mL蒸餾水溶解，將樣品適當稀釋后，用苯酚－硫酸法在490 nm處測定吸光度，根據標準曲線得出多糖含量，低溫保存備用。

1.3.2 實驗分組及給藥劑量[8]

抗疲勞實驗分為對照組、桑黃多糖低劑量組和桑黃多糖高劑量組，每組10只小鼠；

常壓缺氧實驗分為對照組、桑黃多糖低劑量組和桑黃多糖高劑量組，每組10只小鼠；

亞硝酸鈉毒性實驗分為對照組、桑黃多糖低劑量組和桑黃多糖高劑量組，每組10只小鼠。給藥劑量見表1。

1.3.3 小鼠飼養及生長觀察

表1 灌胃方式和劑量

小鼠購回后適應飼養1周，實驗前，選取100只鼠齡一致、體重和形態較為接近的雄性小鼠，按照體重不同分為3個組別，并保證每組的個體體重偏差在±2 g內。小鼠飼養采用自由攝食、飲水。每7天稱量一次小鼠體重，記錄小鼠體重變化[9]。

1.3.4 抗疲勞負重比選擇實驗

小鼠游泳實驗對水溫和室溫要求都較高，在游泳時要保證水溫恒定，室溫與游泳水溫差值應在±2℃內。小鼠的負重比例也是影響實驗效果的重要因素，在正式實驗之前，通過預實驗，對小鼠在一定水溫、室溫和負重情況下的游泳實驗有一定把握，以選擇效果差異較大且合理的負重比。因此，設計4個負重比，分別為3%、5%、7%、10%。

1.3.5 抗疲勞各指標的測定方法

小鼠力竭游泳時間的測定：小鼠末次灌胃給藥1 h后，負重游泳，負重物為小鼠體重5%的鉛皮，水深35 cm，水溫 (25±1)℃。輕輕攪動水面使小鼠不停游動，并打散小鼠毛發上的氣泡。記錄小鼠從入水至力竭時的游泳時間，小鼠頭部入水7 s不上浮時，判定其游泳運動已至力竭。

肝糖原測定：小鼠末次灌胃給藥1 h后，不負重游泳。1 h后停止游泳，立即殺死小鼠，取肝臟經生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，按照肝糖原測試盒說明方法，測定肝糖原含量[10]。

血清乳酸含量的測定：小鼠末次灌胃給藥1 h后，負重4%鉛皮游泳。游泳前、游泳后和游泳后30 min分別采血，血樣離心后按照乳酸 （Lactic Acid LD）測試盒說明方法測定血清乳酸含量。

血清尿素氮含量測定：小鼠末次灌胃給藥1 h后，不負重游泳1 h后停止游泳，小鼠休息1 h后采血，血樣離心后按照尿素氮 （BUN）測試盒說明方法測血清尿素氮含量 [11－12]。

1.3.6 耐缺氧實驗各項指標的測定方法

常壓耐缺氧實驗：末次灌胃給藥1 h后，將各組小鼠分別放入盛有10 g鈉石灰的125 mL廣口瓶中，每瓶1只，涂抹凡士林瓶蓋封口，計時，以呼吸停止為計時終止指標[13]。

亞硝酸鈉毒性實驗：末次灌胃給藥1 h后，稱量小鼠體重， 將每只小鼠以 200/mg·kg－1·bw－1的劑量 i.p.亞硝酸鈉，記錄小鼠從給藥到死亡的存活時間[14－15]。

1.4 實驗數據統計分析

采用SPSS 13.0軟件對各組實驗數據進行單因素方差分析，組間比較用t檢驗。

2 結果與分析

2.1 桑黃多糖對小鼠體重增重的影響

桑黃多糖對小鼠體重的影響見表2。

表2 桑黃多糖對小鼠體重的影響 （x±s，n=10）

經過30 d的桑黃多糖灌胃，高劑量和低劑量多糖灌胃組的小鼠體重與對照組相比，明顯增加，且呈顯著性差異 （P＜0.01， P＜0.05）。 增重與多糖灌胃劑量呈現出正向劑量關系，灌胃桑黃多糖高劑量的小鼠平均體重增重量為15.48 g， 高于低劑量的增重量 14.67 g。

2.2 抗疲勞實驗

負重游泳各項指標 （時間長短，糖原，血乳酸以及血清尿素氮的變化）是機體運動耐力的體現，直接表明機體的疲勞情況與抗疲勞能力[16－17]。

2.2.1 小鼠負重游泳負重比的選擇

小鼠負重游泳負重比選擇結果見表3。

表3 小鼠游泳負重比的選擇結果 （X±s，n=10）

從表3可以看出，在室溫和水溫相同的情況下，不同的負重比對小鼠的游泳時間長短有很大的影響。負重比為3%、7%和10%時，各組小鼠沒有表現出明顯的差異，這可能是3%的負重比過輕，對小鼠自身機能沒有明顯影響，而7%、10%的負重比過重，大大影響了灌胃小鼠的自身機能。結果表明，在選用負重比為5%時，對照組和灌糖組表現出的差異性最為明顯。因此，后期的負重游泳實驗選用5%的負重比。

2.2.2 桑黃多糖對小鼠負重游泳時間的影響

運動耐力的提高是抗疲勞能力加強最直接的表現，游泳時間的長短可以反應動物運動疲勞的程度。桑黃多糖對小鼠負重游泳時間的實驗結果見表4。

從表4可以看出，低劑量和高劑量的桑黃多糖灌胃組與生理鹽水灌胃組相比，小鼠的游泳時間明顯延長，且低劑量組的效果不如高劑量組明顯。高劑量組與對照組相比， 游泳時間明顯延長， 差異顯著 （P＜0.01， P＜0.05）， 而低劑量組的時間也有延長，差異較顯著 （P＜0.05）。因此，桑黃多糖尤其是高劑量可以明顯延長小鼠的游泳時間，增加率達70.62%，即增強小鼠的抗疲勞性，對小鼠的疲勞有顯著的拮抗作用。

表4 桑黃多糖對小鼠負重游泳的影響 （x±s，n=10）

2.2.3 桑黃多糖對小鼠游泳后肝糖原含量的影響。

表5 桑黃多糖對小鼠游泳后肝糖原含量的影響 （x±s，n=10）

從表5可以看出，低劑量和高劑量的桑黃多糖組與生理鹽水組相比，小鼠長時間游泳后的肝糖原儲備量增加，差異達到極顯著 （P＜0.01， P＜0.05）。 低劑量組的作用效果比高劑量組的更為明顯，肝糖原儲備量提高33.36%。因此，桑黃多糖能夠增加小鼠的肝糖原儲備量，具有顯著增強小鼠抗疲勞體質的作用，但多糖的量效關系，并非隨劑量的增加而增強。

2.2.4 桑黃多糖對小鼠游泳后血清乳酸含量的影響

桑黃多糖對小鼠游泳后血清乳酸含量的影響結果見表6。

從表6可以看出，與對照組相比，各劑量組小鼠游泳前血乳酸的差異不顯著 （P＞0.05）；各劑量組小鼠游泳后0min血乳酸含量均低于對照組，差異具有顯著性 （P＜0.05，P＜0.01）；在休息20 min后，高劑量組小鼠游泳后20 min血乳酸含量低于對照組，且均差異極顯著 （P＜0.01）；低劑量組和高劑量小鼠三個時間點的血乳酸曲線下面積都低于對照組，差異均達到了極顯著 （P＜0.01），且高劑量組曲線下面積最小為211.61，相比對照組面積減小22.89%。因此，桑黃多糖能夠降低小鼠劇烈運動后的血乳酸含量，具有顯著的抗疲勞作用。

表6 桑黃多糖對小鼠游泳后血清乳酸含量變化的影響 （x±s，n=10）

2.2.5 桑黃多糖對小鼠游泳后血清尿素氮含量的影響

桑黃多糖對小鼠游泳后血清尿素氮含量的影響結果見表7。

表7 桑黃多糖對小鼠游泳后血清尿素氮含量的影響 （x±s，n=10）

從表7可以看出，小鼠經長時間的游泳，低劑量和高劑量桑黃多糖組的小鼠血清尿素氮含量與生理鹽水組相比， 顯著降低 (P＜0.01， P＜0.05)， 其中， 高劑量組血清尿素氮含量降低較為明顯， 為 7.33 mmol·L－1比對照組降低23.17%。因此，桑黃多糖能夠降低小鼠劇烈運動后的血清尿素氮含量，減輕小鼠運動后的生理負荷，對小鼠的疲勞有顯著的拮抗作用。

2.3 耐缺氧實驗

耐缺氧能力是間接反映抗疲勞能力的一組指標。疲勞的過程中，往往伴隨著組織缺氧，若機體攜氧、利用氧的能力強，就能產生更多的能量，同時減少無氧酵解產生的乳酸，延緩疲勞現象的出現。

常壓耐缺氧實驗是一種以測定小鼠缺氧存活時間為觀測指標的實驗方法，常用于評價抗缺氧作用。亞硝酸鈉會使正常2價鐵血紅蛋白轉變為3價鐵血紅蛋白，破壞血紅蛋白攜氧能力，造成組織缺氧，并表現出相應的缺氧癥狀。本研究通過常壓缺氧以及注射亞硝酸鈉，考察服用桑黃多糖的小鼠耐缺氧能力[18－19]。

2.3.1 桑黃多糖對小鼠常壓耐缺氧能力的影響

桑黃多糖對小鼠常壓耐缺氧時間影響見表8。

從表8可以看出，低劑量組的小鼠常壓耐缺氧時間為32.18 min， 明顯高于對照組的 22.65 min， 存活時間提高42.08%且差異顯著 （P＜0.01， P＜0.05）， 同時也高于高劑量組的23.58 min。而高劑量組與對照組的差異也較明顯（P＜0.05），低劑量組的耐缺氧時間明顯高于高劑量組。因此，低劑量的桑黃多糖能顯著提高小鼠的常壓耐缺氧能力，增強小鼠體質。

表8 桑黃多糖對小鼠常壓耐缺氧時間的影響 （x±s，n=10）

2.3.2 桑黃多糖對小鼠耐亞硝酸鈉毒性的影響

桑黃多糖對小鼠耐亞硝酸鈉毒性的影響實驗結果見表9。

表9 桑黃多糖對小鼠亞硝酸鈉毒性存活時間的影響 （x±s，n=10）

從表9可以看出，對照組的小鼠注射亞硝酸鈉后存活時間為12.78 min，而采用低劑量和高劑量的桑黃多糖灌胃的小鼠存活時間分別為 15.21 min、 15.68 min， 明顯高于對照組的結果，高劑量較對照延長35.29%(顯著性P＜0.01， P＜0.05)。 同時， 低劑量和高劑量組的小鼠存活時間沒有明顯差異。因此，桑黃多糖能夠顯著提高小鼠耐亞硝酸鈉毒性的能力，增強其體質。

3 結論與討論

20世紀70年代以來，藥用真菌多糖的研究開發進入了一個嶄新的發展時期。這些藥用真菌多糖的研究主要集中在靈芝，蟲草等一些常見真菌，對桑黃多糖的抗疲勞活性研究還尚少。

桑黃菌絲體經熱水浸提、乙醇沉淀去除小分子量糖分，得到分子量較大的桑黃菌絲體粗多糖，與文獻報道的活性桑黃多糖分子量范圍相符，本文對其進行了進一步活性研究。

疲勞是一個綜合性的生理過程，涉及了很多的生理和生化因素，它是人體腦力活動或者體力活動達到一定階段時，機體必定會表現出的一種正常的生理現象，疲勞既是機體原有的工作能力暫時下降的表現，又是機體可能發展到傷病狀態的一個先兆[5,10,11]。灌胃桑黃多糖抗疲勞實驗表明，低、高劑量組小鼠的游泳實驗各項指標均明顯優于生理鹽水組，即桑黃多糖對有關疲勞的生化指標有著積極的影響，可以提升機體的運動耐力，具有抗疲勞作用；同時灌胃劑量的高低對抗疲勞的作用效果也有差異，以上結果顯示出在一定劑量范圍內，桑黃多糖劑量越高，抗疲勞功效越顯著。

缺氧對機體是一種緊張性刺激，影響機體各種代謝，特別是影響機體的氧化功能，最終會導致機體的心、腦等主要器官缺氧供給不足而死亡[9,12,16]。灌胃桑黃多糖耐缺氧實驗表明，桑黃多糖能顯著延長小鼠常壓耐缺氧條件下的存活時間，同時減少機體受亞硝酸鈉毒性影響，增加血液攜氧能力，清除血液中的自由基，從而延長小鼠的喘氣時間，提高小鼠對缺氧的耐受能力，同時灌胃劑量的差異對常壓耐缺氧也有不同的效果，低劑量的桑黃多糖能顯著提高小鼠的常壓耐缺氧能力，但是劑量高低對小鼠耐亞硝酸鈉毒性的能力沒有明顯差異。然而，桑黃活性多糖的成分及其深層的作用機制尚待進一步研究。

綜上所述，桑黃多糖可以提高小鼠的抗疲勞和耐缺氧能力，從而可為桑黃走向保健品、藥品市場提供實驗依據。隨著桑黃菌絲體規模化生產的實現，與之相關的生物產品，在職業疲勞人群和老年人群中必將具有廣闊的市場前景。

[1]宋力，孫培龍等.桑黃的研究進展[J].中國食用菌，2004,24(3):7-10.

[2]戴玉成.藥用擔子菌-鮑式層孔菌 (桑黃)的新認識 [J].中草藥，2003，34(1):94-95.

[3]李國俊，吳國用等.裂蹄木層孔菌菌絲培養及其應用研究 [J].中國食用菌，1998，72(5):27-28.

[4]衛生部衛生監督司.保健食品檢驗與評價技術規范[Z].北京：中華人民共和國衛生部，2003:87-93.

[5]黃林章，黃寶康等.中藥抗疲勞作用機制的研究進展[Z].現代藥物與臨床，2010，25(3):161-165

[6]周勇.桑黃水溶性多糖的分離純化及結構的初步研究[D].長春：吉林農業大學，2007.

[7]陳瑜，梁運祥等.固體發酵靈芝菌絲多糖的提取及組分分析 [J].中國食用菌，2007，26(3):34-37.

[8]李儀奎.中藥藥理實驗方法學 [M].上海：上海科學技術出版社，2006:10-13，148-154.

[9]張勇，張立實等.保健食品提高缺氧耐受力功能實驗結果分析[J].現代預防醫學，2004，31(3):341-345.

[10]包怡敏，許家佗.中藥抗運動性疲勞的現代研究進展[J].中國中醫基礎醫學雜志，2008，14(10):800-802.

[11]羅瓊.純品枸杞果糖對小鼠抗疲勞的效果[J].武漢大學學報 （自然科學版），1999，45(4):501.

[12]曹寅，胡園等.開心散對缺氧和力竭運動小鼠的抗氧化及抗疲勞作用研究[J].2011，27(4):307-313.

[13]QIN Ru-lan， MENG Qing-shuang.Effects of Total Saponins from Ranunculus japonicus on Hypoxia Tolerance and Memory Ability of Mice[J].Medicinal Plant， 2011， 2(6):41-42.

[14]劉衡川，張弘等.高氧水耐缺氧、抗疲勞作用機制初探[J].四川大學學報 （醫學版），2005，36(1):74-76.

[15]鄒梅，孫蘭等.中保牌健生膠囊的耐缺氧作用 [J].中國實用醫藥，2009，4(13):127-128.

[16]侯春麗，閆守扶等.運動性疲勞的細胞基質及研究進展[J].首都體育學院報，2004，23(2):196.

[17]羅金花，屈紅林.復方中藥對實驗小鼠抗疲勞效果的研究[J].時珍國醫國藥，2008，19(8):1975-1976.

[18]Reddy KV， Kumar TC， et al..Pulmonnary lipid peroxidation and antioxidant defenses during exhaustive physical exercise:the role of vitamin E and selenium[J].Nu-trition， 1998， 14(5):448-451.

[19]Liu W， Zhao W， et al..Clinical pathological study of treatment of chronic hepatitis with hyperbaric oxygenation[J].Chinese Medical Journal， 2002， 115(8):1153-1161.