香菇多糖增強5－FU抑制結腸癌細胞增殖機制研究

袁昌勁，孔慶志，盧宏達，孔雙喜

（1.武漢市中心醫院 腫瘤科，湖北 武漢430014；2.華中科技大學附屬同濟醫院 腫瘤科）

香菇多糖主要為甘露糖甘肽，其余為多種糖分和各種氨基酸等，對光和熱穩定，不溶于甲醇、乙醇和丙酮等有機溶劑［1］，聯合抗腫瘤藥物對胃癌［2］、結腸癌［3］、肺癌［4］等腫瘤具有良好的療效，顯著延長腫瘤患者存活時間。目前對香菇多糖的抗腫瘤機制仍然不清楚，一般認為和免疫調節有關。香菇多糖是典型的T細胞激活劑，體內外均能促進細胞毒T淋巴細胞（CTL）的產生，提高CTL細胞殺傷力，增強正常或免疫功能低下小鼠的遲發型超敏反應，提高抗體依賴性細胞毒作用，同時能結合到人單核細胞上激活內源性信號傳導通路［5，6］。本文應用香菇多糖及5－FU處理SW480結腸癌細胞，探討其對細胞增殖和凋亡的影響，并研究其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

SW480結腸癌細胞購于美國ATCC，RPMI－1640、雙抗和FBS購于Gibco公司，MTT試劑購于Sigma公司，RNA 提取和 RT－PCR試劑盒購于Takara公司，引物由上海生工公司合成，香菇多糖采用南京康海藥業有限公司的香菇多糖凍干粉劑，5－FU購于Sigma公司。

1.2 細胞培養和藥物處理

SW480結腸癌細胞完全培養基為10%FBS、89%RPMI－1640和1%雙抗，培養條件為37℃、5%CO2恒溫培養箱，實驗時取對數生長期細胞。香菇多糖凍干粉劑用生理鹽水配制成5μmol／ml，5－FU用生理鹽水配制成500mg／L存儲液，根據王峻［7］和Harada［8］等研究，使用時加入完全培養基配制如下濃度工作液①Len組：Lentinan終濃度0.05 μmol／ml；②FU組：5－FU終濃度100mg／L；③L＋F組：Lentinan終濃度0.05μmol／ml和100mg／L 5－FU終濃度。

1.3 MTT法檢測細胞增殖

每孔1000個細胞接種于96孔板，每孔200μl，加入工作液處理24h后，PBS洗滌3次更換新鮮培養基培養。每天MTT法檢測一孔，每孔加入5 mg／ml MTT溶液20μl，37℃孵育4h后棄去，加入DMSO 50μl，振蕩15min充分溶解結晶，酶標檢測儀上測定波長為490nm下的吸光值（A值），每孔細胞吸光度＝測得值－空白對照孔值。以吸光值為縱坐標，以時間（天）為橫坐標，繪制Len組、FU組、L＋F組和正常未處理組SW480結腸癌細胞增殖曲線。

1.4 流式細胞儀檢測細胞周期及細胞凋亡

藥物處理24h后收集細胞并離心，細胞沉淀用PBS洗滌，加入標記有異硫氰酸熒光素的連接素Annexin V－FITC和碘化丙錠，避光孵育15min后檢測細胞凋亡，另制成200μl細胞懸液，加入70%的冰乙醇5ml－20℃固定24h以上，加入RNase A 200μl，37℃溫育30min，加入碘化丙啶至終濃度50mg／L，檢測細胞周期。增殖指數（PI）＝（S＋G2／M）／（G0／G1＋S＋G2／M）。

1.5 RT－PCR檢測多藥耐藥基因 MDR1、MRP1和LRP表達

按照RNA提取試劑盒說明提取細胞總RNA，用β－actin作為內參照進行RT－PCR擴增，引物序列參見表1。PCR反應體系為25μl，反應參數：94℃預變性5min，94℃變性45s，表1基因對應退火溫度退火30s，72℃延伸30s，共35個循環，最后一輪72℃延伸10min。PCR產物經20g／L瓊脂糖凝膠電泳后檢測。

1.6 統計學分析

應用SPSS12.0進行數據處理與統計分析。采用t檢驗，P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 SW480結腸癌細胞增殖

正常對照組SW480結腸癌細胞表現為對數增殖狀態，單獨5－FU處理后，增殖速度較對照組顯著降低，增殖速度降低，細胞增殖受到抑制；單獨香菇多糖對細胞增殖無明顯影響，聯合5－FU作用后的細胞增殖速度顯著降低（圖1）。

表1 MDR1、MRP1和LRP基因RT－PCR反應序列和退火溫度

2.2 細胞形態與凋亡

鏡下觀察，FU組SW480結腸癌細胞體積縮小、死亡，細胞密度較對照組降低；Len組結腸癌細胞無明顯細胞體積縮小和死亡，細胞密度和對照組無明顯區別；香菇多糖聯合5－FU處理后，死亡細胞增加，細胞密度較對照組顯著降低，明顯低于FU組。Len組與對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05），FU組G0／G1期細胞明顯增加，S期細胞降低，PI明顯降低，細胞凋亡率顯著提高（P＜0.05），L＋F組與FU組和對照組相比，細胞凋亡率顯著增加，PI降低，細胞停滯于G0／G1期，差異具有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

圖1 SW480結腸癌細胞增殖曲線

表2 SW480結腸癌細胞細胞周期與凋亡（±s）

表2 SW480結腸癌細胞細胞周期與凋亡（±s）

與對照組相比，＊P＜0.05，＃P＞0.05；a、b和c之間，P＜0.05

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2.3 RT－PCR檢測耐藥基因表達

正常對照組SW480結腸癌細胞均可檢測到MDR1、MRP1和LRP基因mRNA表達，加入5－FU藥物處理后，MDR1基因表達增加，MRP1和LRP基因表達無明顯變化。香菇多糖能顯著降低MDR1和MRP1基因表達，而對LRP表達無影響。香菇多糖聯合5－FU抑制MDR1和MRP1基因表達，表達呈缺失狀態，而對LRP基因表達無影響（圖2、圖3和圖4）。

3 討論

圖2 MDR1基因mRNA表達

圖3 MRP1基因mRNA表達

圖4 LRP基因mRNA表達

接受化療的患者在初次或再次接受化療時可能出現耐藥現象，藥物敏感度低于正常人。目前認為腫瘤細胞的耐藥主要和誘導表達多藥耐藥基因相關，多藥耐藥基因主要包括MDR1、MRP1和LRP［9］。MDR1基因編碼產物P－糖蛋白位于細胞膜，由兩個完全相同的單體結構構成每個單體有一個ATP結合位點，跨膜區域構成藥物通道盒式結構，ATP結合位點與能量供應有關，P－糖蛋白利用ATP水解功能將抗腫瘤藥物泵出胞膜外［10］。MRP1基因編碼的多藥耐藥相關蛋白1屬于非P－gp跨膜糖蛋白ATP依賴泵，能將帶負電荷的藥物分子逆濃度泵出到胞外，減少胞內藥物濃度，還可改變細胞漿及細胞器的pH值，使藥物到達作用部位的靶位點時濃度減少，避免藥物與靶點結合，直接參與腫瘤的轉移［11］。LRP廣泛分布于正常組織，使順鉑不能通過核孔進入細胞核，阻止以胞核為效應點的藥物轉運到胞漿中；將進入胞漿的藥物轉運到運輸囊泡中，起隔絕藥物作用，最終通過胞吐的方式到細胞外，主要介導烷化劑的耐藥［12］。目前研究表明，人工抑制多藥耐藥基因表達能顯著改善耐藥現象，提高化療藥物的療效。

5－FU為細胞周期特異性藥，主要抑制S期細胞。在體內轉變為5－氟－2－脫氧尿嘧啶核苷酸，抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻斷脫氧尿嘧啶核苷酸轉變為脫氧胸腺嘧啶核苷酸而抑制DNA的生物合成。研究表明，梯度5－FU濃度刺激導致細胞多藥耐藥基因表達增加，利用該機制已經成功制備5－FU耐藥細胞株［13，14］。本研究表明 5－FU 接觸 SW480結腸癌細胞后，MDR1表達增加，該現象與Theile等［15］研究一致。香菇多糖能顯著降低 MDR1和MRP1基因表達，而對LRP表達無影響，其具體作用機制有待進一步研究。

5－FU為S周期特異性抑制劑，抑制細胞進入有絲分裂器，本研究也證實該現象。5－FU聯合香菇多糖后，細胞仍然表現為停滯于G0／G1期特點，表明香菇多糖并沒有改變5－FU作用特點，但細胞增殖速度明顯降低，凋亡增加，我們推測是香菇多糖增加了SW480結腸癌細胞對5－FU的敏感性。香菇多糖能顯著降低多藥耐藥基因表達，正是該機制導致SW480對5－FU誘導耐藥作用減少，從而增加了細胞對5－FU的敏感度，但兩者之間是否存在因果關系，有待進一步研究。

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