HPLCELSD法測定妥布霉素的有關物質

張亞紅，米亞嫻，高立勤，吳 燕，袁雯瑋

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

妥布霉素是黑暗鏈霉菌(Streptomyces tenebrarius)發酵液中提取得到的具有廣譜抗菌活性的氨基糖苷類抗生素，對革蘭陽性菌和陰性菌均有良好的抗菌作用，尤其對銅綠假單孢菌感染具有高效的抗菌作用。據文獻報道[1]，該鏈霉菌發酵液中除妥布霉素外，尚存在含量不等的10多種其他氨基糖苷組分，且這些組分理化性質與妥布霉素近似。由于該品種缺乏紫外吸收，為了嚴格控制產品質量，《美國藥典》31版采用TLC法測定有關物質，《英國藥典》2008和《歐洲藥典》6.0均采用高效液相色譜-脈沖電流檢測器法，楊茂俊[2]等采用柱前衍生化法測定這些氨基糖苷有關物質的含量。

衍生化法和TLC法操作煩瑣，實驗條件對結果影響較大，脈沖電流檢測器價格昂貴，國內不普及。近年來國內外陸續有文獻報道采用蒸發光散射檢測技術分析氨基糖苷類抗生素[3-5]。本文建立高效液相色譜-蒸發光散射檢測器(HPLC-ELSD)法測定妥布霉素的有關物質，為該技術的進一步推廣和應用提供實驗基礎。

1 材料

島津HPLC高效液相色譜儀；Alltech ELSD 2000蒸發光散射檢測器；妥布霉素標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號0340-200002Z，每1 mg相當于880 U)；卡那霉素B標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號130548-200501)；暗霉胺標準品(某國外企業提供)；妥布霉素為國內A藥廠(編號為1#、2#、3#)、B藥廠(編號為4#、5#、6#)和C藥廠(編號為7#、8#、9#)提供。

2 方法與結果

2.1色譜條件 Phenomenex Gemeni色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以0.2 mol/L的三氟醋酸為流動相；流速：0.4 ml/min；柱溫：30 ℃；蒸發光散射檢測器條件：漂移管溫度：110 ℃；載氣流速：3.0 L/min；靈敏度Gain=1；撞擊器模式：off模式。進樣量：10 μl。

2.2系統適用性試驗 取妥布霉素標準品和卡那霉素B標準品適量，加水制成每1 ml中約含0.25 mg的混合對照溶液，照上述色譜條件進樣10 μl，記錄色譜圖，見圖1。妥布霉素峰與卡那霉素B峰能完全分離，分離度為1.61，妥布霉素峰的對稱因子為1.16 ，理論板數按妥布霉素峰計為11 744。

2.3溶液制備

2.3.1供試品溶液 取本品，用水溶解并定量稀釋成每1 ml中約含4 mg的溶液，作為供試品溶液。

2.3.2對照溶液 精密量取供試品溶液適量，加水定量稀釋制成每1 ml中約含12 μg(0.3%)、24 μg(0.6%)和48 μg(1.2%) 的溶液，作為對照溶液(1)、(2)、(3)。

1.卡那霉素B 2.妥布霉素圖1 系統適用性試驗色譜圖

2.4線性關系及最低檢出限 取妥布霉素、暗霉胺、卡那霉素B對照品各約25 mg，置100 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取4、6、8、10和25 ml，分別置50 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為系列濃度線性溶液，精密量取線性溶液各10 μl，依“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，以對照溶液濃度的對數值與相應的峰面積的對數值計算回歸方程，結果線性范圍分別為：妥布霉素20～120 μg/ml、卡那霉素B 19.1～114.6 μg/ml、暗霉胺23.6～141.6 μg/ml，妥布霉素、暗霉胺和卡那霉素B的回歸方程及相關系數分別為Y=1.625 8X+0.973 5(r=0.999 7)、Y=1.621 2X+0.829 1(r=0.999 4)和Y=1.628 7X+0.760 5(r=0.997 1 )。以妥布霉素計，本方法最小檢出濃度為5.80 μg/ml。

2.5穩定性試驗 取供試品溶液在室溫分別放置0、1、2、4、6和8 h時，依“2.1”項下色譜條件進樣，測定并計算有關物質含量，結果表明：供試品溶液在室溫放置8 h內穩定。見表1。

表1 供試品溶液室溫放置穩定性測定結果

2.6樣品測定 精密量取對照溶液和供試品溶液各10 μl，依“2.1”項下色譜條件，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質峰，用回歸方程計算供試品中各雜質的含量。采用建立的HPLC-ELSD法測定三個廠家的妥布霉素，發現主要雜質為暗霉胺，其次為卡那霉素B，產品質量較高的樣品，單個雜質的含量在0.2%以下，氨基糖苷雜質總量不超過0.5%。樣品測定結果見表2。根據新霉胺、暗霉胺與卡那霉素B標準品分別測定得到的保留時間定位，供試品溶液色譜圖見圖2。

表2 樣品有關物質測定結果

1.新霉胺 2.暗霉胺 3.卡那霉素B 4.妥布霉素圖2 典型供試品溶液色譜圖

3 討論

3.1計算方法的選擇 蒸發光散射檢測器為質量型檢測器，其工作原理為散射光的對數響應值與組分質量的對數值呈線性關系，即供試品溶液濃度的對數值與相應峰面積的對數值呈線性，故不宜用單點的對照溶液峰面積作比較。只能通過自身對照線性回歸方程來計算有關物質的含量。

3.2校正因子的測定 在方法研究時，對妥布霉素以及已知雜質卡那霉素B、暗霉胺進行了校正因子的測定，濃度范圍分別為：妥布霉素20～120 μg/ml、卡那霉素B 19.1～114.6 μg/ml、暗霉胺23.6～141.6 μg/ml，暗霉胺與卡那霉素校正因子分別為0.997 2和1.008 1，因此本方法計算時可不加校正因子。

3.3對照溶液的選擇 試驗證明，不同pH值的供試品溶液經HPLC分析，用蒸發光散射檢測器檢測時，其響應值有較大的差異。為保證結果的正確性，供試品溶液與對照溶液的pH值應一致。故本標準采用供試品溶液稀釋的自身對照法。

測定三個濃度(0.3%、0.6%和1.2%)和六個濃度(0.25%、0.3%、0.5%、1.0%、2.0%和3.0%)的自身對照溶液并進行線性回歸，用上述兩個回歸方程分別計算雜質含量，結果基本一致，考慮本方法為有關物質檢查，采用三個濃度的回歸方程法，足以滿足測定結果精度要求，故本方法規定用0.3%、0.6%和1.2%三個濃度作為自身對照溶液的三個濃度。

3.4分離度參照物的選擇 依據“2.1”項下色譜條件，對妥布霉素中可能存在的有關物質卡那霉素B、新霉胺及暗霉胺進行考察，結果出峰順序依次為新霉胺、暗霉胺、卡那霉素B和妥布霉素，卡那霉素B與妥布霉素保留時間最為接近，且卡那霉素B標準品容易獲得，故用來作為系統適用性試驗中測定分離度的參照物。

1 Koch K F,Merkel K E,O’Connor S C，etal.Structures of some of the minor aminoglycoside factors of the nebramycin fermentation. J Org Chem，1978，43:1207

2 楊茂俊，吳章秀.高效液相色譜法分析國產妥布霉素及有關物質.中國抗生素雜志，1996，21(s)：73

3 王明娟，胡昌勤，金少鴻.采用HPLC-ELSD法分析小諾米星及其有關物質.藥物分析雜志，2002，22(3)：205

4 王明娟，胡昌勤，金少鴻.高效液相色譜-蒸發光散射檢測法分析慶大霉素C組分. 藥物分析雜志，2002，22(6)：461

5 Vogel R,DeFillipo K,Reif V.Determination of isepamicin sulfate and related compounds by high performance liquid chromatography using evaporative light scattering detection. J Pharm Biomed Anal,2001,24(3):405