木瓜花粉生活力測定及儲藏特性

管 雨，賈文慶，劉會超，張智俊

（1.浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300；2.河南科技學院 園林學院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

木瓜Chaenomeles sinensis為薔薇科Rosaceae木瓜屬Chaenomeles落葉小喬木，是優(yōu)良的觀花、觀果、觀樹皮樹種，其果實可供食用、藥用，素有“百益之果”“萬壽瓜”之雅稱。近年來，木瓜的美容護膚作用逐漸受到化妝品行業(yè)的重視，利用木瓜果實加工罐頭、果脯、果汁等保健食品更是方興未艾。花粉生活力是評估花粉細胞活性的依據(jù)之一，其生活力測定結果的準確性決定著細胞學試驗和雜交育種的成敗[1]。花粉生活力的強弱受遺傳因素和環(huán)境因素的影響，也是人工輔助授粉成敗的關鍵。花粉萌發(fā)率雖不能完全等同于其生活力，但在雜交育種實踐中多以花粉萌發(fā)率來表示其生活力[2－3]。花粉生活力的測定是保證花粉質量的重要途徑，對花粉的儲藏有著十分重要的意義。國內外對木瓜的研究主要集中在藥用、栽培和加工技術。關于木瓜花粉生活力的研究尚未見報道。本研究通過培養(yǎng)基萌發(fā)法、染色法，對不同儲藏條件下木瓜花粉生活力進行了研究，以期為木瓜的生產(chǎn)、遺傳育種、基因庫的保存提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料的采集與處理

試驗材料取自河南科技學院綠化區(qū)15年生木瓜。于2011年4月12日木瓜盛花期采集樹冠外圍健壯枝條上含苞待放的花蕾，帶回實驗室后用鑷子剝取花藥，剔除破裂或帶花絲的花藥，放在培養(yǎng)皿中，置于（25±1）℃的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2 h后，收集花粉備用。

1.2 培養(yǎng)基萌發(fā)試驗法

1.2.1 花粉萌發(fā)最適培養(yǎng)基的確定 采用二因子完全隨機試驗，蔗糖質量濃度為0，50，100，150，200 mg·L-1，硼酸質量濃度為0，10，20，30，40 mg·L-1，瓊脂8 g·L-1。分別取2滴已配置好的培養(yǎng)基于凹玻片凹槽內，待冷卻后將木瓜花粉均勻撒播在固體培養(yǎng)基上，然后將玻片放在有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，蓋上皿蓋，放入（25±1）℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。在同一時間內，觀察統(tǒng)計木瓜花粉的萌發(fā)率。處理重復5次，各重復鏡檢3個視野（花粉數(shù)≥50粒·視野-1），花粉萌發(fā)以其花粉管長度超過花粉直徑為標準。花粉萌發(fā)率（%）=（萌發(fā)花粉數(shù)/總花粉數(shù)） ×100%。

1.2.2 花粉萌發(fā)最佳觀察時間的確定 配制由2.1.1篩選出的花粉萌發(fā)最佳培養(yǎng)基，酸堿度調至pH 5.6～5.8。采用1.2.1所述方法進行播種，培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計花粉萌發(fā)率。培養(yǎng)時間分別設為2，4，6，8，10 h。

1.3 碘-碘化鉀（I-KI）染色法

稱取碘化鉀2 g，溶解于7 mL的蒸餾水中，再加入1 g碘，待全部溶解后，用蒸餾水定溶至100 mL，配置成I-KI溶液，置于4℃冰箱內以備待用。然后用經(jīng)過乙醇棉球消毒的發(fā)絲蘸取少量花粉放于載玻片的凹槽內，加水1滴，使花粉散開，再加1滴I-KI溶液，靜置3～4 min后，在顯微鏡下觀察。根據(jù)淀粉遇碘變藍的特性，從藍色的深淺程度來判斷花粉中淀粉含量的多少。觀察時，每個凹槽取3個視野，計算有生活力花粉所占的百分率。凡被染紅色花粉活力強，淡紅次之，無色者為沒有活力或不育花粉，統(tǒng)計花粉的染色率，以染色率表示花粉活力。

1.4 氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法

稱取0.25 g TTC放入燒杯中，加入少許體積分數(shù)為95%乙醇使其溶解，用蒸餾水稀釋至50 mL，制成體積分數(shù)為0.5%TTC溶液，置于4℃冰箱中以備待用，方法同I-KI染色法。花粉粒凡被染成紅色的為有生活力，否則為無生活力或是花粉敗育。

1.5 不同儲藏條件對木瓜花粉萌發(fā)的影響試驗

花粉儲藏條件試驗：花粉采集陰干后，裝入35支2 mL離心管分別儲藏于以下環(huán)境：A為常溫，B為常溫+干燥劑，C為4℃儲藏，D為-23℃儲藏，E為-80℃儲藏。8支處理，各次測定分別取出2支。儲藏8，16，24，32 d后，按照在1.2.2確定的最佳培養(yǎng)基培養(yǎng)時間觀察統(tǒng)計花粉萌發(fā)率，直到視野中很難找到萌發(fā)的花粉時停止觀察。花粉耐儲藏力是以待測花粉活力保持時間即待測樣自收集到花粉活力降為0的時間長度來表示。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基萌發(fā)試驗法

2.1.1 花粉萌發(fā)最適培養(yǎng)基（含蔗糖和硼酸）的確定 表1表明：蔗糖質量濃度100 mg·L-1與150 mg·L-1差異達到了顯著水平，其他質量濃度差異不顯著，100 mg·L-1效果最好；硼酸質量濃度20 mg·L-1與30 mg·L-1差異達到了顯著水平，其他濃度差異不顯著，30 mg·L-1效果最好。對照處理0 mg·L-1蔗糖+0 mg·L-1硼酸萌發(fā)率最低。蔗糖質量濃度相等的條件下，木瓜花粉在30 mg·L-1硼酸培養(yǎng)基的萌發(fā)率約是10 mg·L-1硼酸培養(yǎng)基的2.5倍。同理，硼酸質量濃度相等的條件下，木瓜花粉在100 mg·L-1蔗糖上的萌發(fā)率約是在含50 mg·L-1蔗糖培養(yǎng)基上的3.6倍。用100 mg·L-1蔗糖分別與20，30，40 mg·L-1的硼酸測定的花粉萌發(fā)率分別是26.54%，75.09%和35.65%，木瓜花粉在100 mg·L－1蔗糖+30 mg·L－1硼酸的培養(yǎng)基上萌發(fā)率最高，因此，100 mg·L－1蔗糖+30 mg·L－1硼酸是最佳組合的培養(yǎng)基。

表1 木瓜花粉在完全隨機試驗中的萌發(fā)率Table1 Germination rate of pollen of Chaenomeles sinensis in completely randomized trials

2.1.2 花粉萌發(fā)最佳觀察時間的確定 木瓜花粉在不同時間的萌發(fā)率是有差異的。圖1表明：在培養(yǎng)箱中放置2～6 h，隨著時間的延長花粉萌發(fā)率逐步提高，6 h的木瓜花粉萌發(fā)率達到最高，為72.27%，8 h后觀察結果與10 h相近，花粉的萌發(fā)率趨于平穩(wěn)，說明6 h時有生活力的花粉已萌發(fā)完畢，不再隨時間的延長而萌發(fā)，故隨后的試驗均在培養(yǎng)6 h后統(tǒng)計花粉生活力。

2.2 碘-碘化鉀（I-IK）染色法

多數(shù)植物正常的成熟花粉粒積累有較多的淀粉，I-KI溶液可將其染成藍色。觀察發(fā)現(xiàn)：利用I-KI染色法測定木瓜花粉的生活力，花粉細胞出現(xiàn)了藍色（17.94%）和黃褐色 （82.06%）2種顏色反應，而且隨時間的變化波動不大，與培養(yǎng)基萌發(fā)最高萌發(fā)率達75.09%相比，差距較大。I-KI染色法不能真實體現(xiàn)木瓜花粉的生活力可能是由于木瓜花粉細胞淀粉含量低造成的，所以不適合木瓜花粉生活力的測定。

圖1 培養(yǎng)時間對花粉生活力的影響Figure1 Effect of culture time on pollen viability

2.3 氯化三笨基四氮唑（TTC）染色法

具有活性的細胞產(chǎn)生的NADH2（黃素腺嘌呤二核苷酸）或NADPH（三磷酸吡啶核苷酸）可將無色的TTC（氯化三苯基四氮唑）還原成紅色的TTF（三苯基甲）而使本身染成紅色，次活力的被染成淡紅色，而無活力的花粉因呼吸作用較弱，顏色變化不明顯。

觀察發(fā)現(xiàn)：利用TTC染色法測定木瓜花粉的生活力，花粉細胞出現(xiàn)了紅色（60.46%），淡紅色（25.54%）和無色（14.00%）3種顏色反應，且隨時間的延長，細胞的染色率變化不大。利用TTC法測定的木瓜花粉的活力（活性細胞和次活性細胞的總和）與利用培養(yǎng)基培養(yǎng)法最高萌發(fā)率達75.09%相接近。用該方法可以快速進行花粉的活力測定，具有時間短、操作簡便的優(yōu)點。

2.4 不同儲藏條件下花粉的萌發(fā)

由表2可知：不同的儲藏條件對木瓜花粉生活力的影響有顯著差異。在常溫儲藏、常溫干燥儲藏、－23℃冷凍儲藏時，儲藏前期花粉生活力下降緩慢，而后期下降較快，至24 d后花粉基本失去生活力；4℃冷藏，花粉生活力維持時間相對較長，比－23℃冷凍儲藏效果略好，可能由于冷凍條件會使細胞過度脫水，不利于花粉生活力的維持；－80℃超低溫冷凍儲藏條件下，8～32 d時間內，花粉生活力保持相對平穩(wěn)，至32 d時萌發(fā)率仍有15.3%，并且記錄了在此期間花粉的萌發(fā)狀態(tài)（圖2）。這說明木瓜花粉在超低溫冷凍儲藏條件下能維持的相對時間最長。

表2 不同儲藏條件下花粉萌發(fā)率Table2 Germination rate of the pollen under different storage conditions

3 小結與討論

3.1 培養(yǎng)基萌發(fā)試驗法

在培養(yǎng)基萌發(fā)試驗中，蔗糖為植物花粉萌發(fā)和花粉管的生長提供了營養(yǎng)及維持著培養(yǎng)液之間的滲透平衡。高質量濃度的蔗糖能改變花粉管的透性，導致代謝物質和離子泄露在培養(yǎng)基里，從而使花粉及花粉管的破裂，對萌發(fā)不利[4]。本試驗表明，蔗糖質量濃度低于或大于100 mg·L－1時，均不利于木瓜花粉的萌發(fā)，因此，蔗糖不僅在花粉萌發(fā)中提供所需營養(yǎng)，還參與其他的代謝功能。筆者認為：作為一種能量來源，如葡萄糖、砂糖（主要成分是蔗糖）等可以調節(jié)其質量濃度，同樣可以保持較高的花粉萌發(fā)率。

大多數(shù)植物在含有硼和滲透壓調節(jié)劑的培養(yǎng)液中會促使花粉及花粉管的萌發(fā)。但在自然條件下花粉的硼元素是缺乏的，而由比較高濃度的柱頭、花柱內的硼所補償[5-6]。硼在花粉萌發(fā)中參與了諸多的生理活動，如糖的吸收、運轉、代謝和氧的吸收，參與果膠的合成等過程[7]。本試驗表明：在離體條件下，適宜質量濃度的硼處理能有效提高花粉的萌發(fā)率，在硼酸質量濃度為30 mg·L－1，有利于木瓜花粉的萌發(fā)，但在未添加硼酸的培養(yǎng)基內木瓜花粉萌發(fā)速度較慢，且高質量濃度起抑制作用，硼酸質量濃度為50 mg·L－1，培養(yǎng)2 h后萌發(fā)率僅為9.33%。因此，適宜的硼酸質量濃度有利于木瓜花粉的萌發(fā)，過高或過低都不利于其萌發(fā)；花粉萌發(fā)率的高低除了和花粉發(fā)育時期、花粉本身的質量有關外，還與萌發(fā)時的溫度、營養(yǎng)物質、礦質元素等環(huán)境條件密切相關。

3.2 染色法測定木瓜花粉生活力

花粉活力是評估花粉細胞活性的依據(jù)之一，其活力測定結果的準確性決定細胞學實驗和雜交育種的成敗。利用染色法進行花粉生活力測定具有快速簡便的優(yōu)點，但受花粉自身特性（如花粉壁厚度，組成花粉外壁的物質特性及花粉內酶活性的強弱等）的影響較大，因此，不同的染色法只適合某些植物花粉生活力的測定。TTC染色法適用于錦帶花Weigela florida[8]，芍藥Paeonia lactiflora[9]等的花粉生活力測定。本試驗的結果表明：TTC染色法的實驗結果較接近培養(yǎng)基萌發(fā)試驗法，能真實地反映木瓜花粉的生活力，說明TTC染色法適用于對木瓜花粉生活力的測定。一般來說，I-KI染色法對大多數(shù)植物都是不適合的。

3.3 不同儲藏環(huán)境條件下花粉萌發(fā)試驗

花粉生活力的強弱受遺傳因素和環(huán)境因素的影響。經(jīng)過初步試驗發(fā)現(xiàn)：木瓜花粉在儲藏過程中溫度是影響其萌發(fā)率的主要因素，干燥和低溫有助于維持花粉生活力。有報道[10]指出，低溫保存的花粉比新鮮花粉有更高的離體萌發(fā)率，但不同的種及品種所需低溫不同。本試驗表明：木瓜花粉在不同的儲藏條件下，生活力有很大差異，只有在適宜的儲藏條件下，才具有一定的萌發(fā)力，在－80℃條件下儲藏32 d，花粉萌發(fā)率仍達15.3%，因此，筆者建議在生產(chǎn)實踐中于超低溫條件下儲藏木瓜花粉，以便木瓜花粉保持活力的時間更長，有利于種質資源的保存。

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