中國林蛙卵油HPLC數字化指紋圖譜研究

2012-05-26 07:57:00孫國祥

中成藥 2012年6期

關鍵詞：評價系統

姜玢，孫國祥

（1.鞍山市食品藥品檢驗所，遼寧鞍山114006；2.沈陽藥科大學藥學院，遼寧沈陽 110016）

中國林蛙卵油HPLC數字化指紋圖譜研究

姜玢1，孫國祥2*

（1.鞍山市食品藥品檢驗所，遼寧鞍山114006；2.沈陽藥科大學藥學院，遼寧沈陽 110016）

目的建立中國林蛙卵油（Forest Frogs Oviduct）HPLC數字化指紋圖譜。方法采用反相HPLC法以Century SIL C18BDS柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水-磷酸（80∶20∶0.15），檢測波長210 nm，柱溫（35.0±0.15）℃，進樣量20 μL。用“中藥色譜指紋圖譜超信息特征數字化評價系統3.0”軟件進行數字化評價。結果以亞油酸（Linoleate）為參照物峰，確定21個指紋峰，獲得了可以判別其質量的重要數字化信息，并以系統指紋定量法鑒別出S7、S10質量極好，其余批次的質量等級為很好。結論所建立的中國林蛙卵油HPLC數字化指紋圖譜方法穩定、可靠，可用于中國林蛙卵油的質量控制。

中國林蛙卵油；HPLC數字化指紋圖譜；超信息特征；系統指紋定量法；統一化色譜指紋圖譜

中國林蛙Rana temporaria chensinesisDavid是兩棲綱無尾目蛙科蛙屬動物，俗稱哈士蟆，其雌蛙的干燥輸卵管稱為林蛙油。中國林蛙卵油為取蛙油剩余的卵經超臨界萃取而得。中國林蛙卵油主含不飽和脂肪酸等，含有18種氨基酸，其中必需氨基酸的總量為28.93%；富含雌二醇與磷脂；含有維生素A、D、E、C等及人體必需的微量元素及多種微量元素［1-4］。目前對中國林蛙卵油的研究多集中在成分研究和藥理作用的研究，質量控制研究仍然不足。作者已經對中國林蛙卵油進行氣相色譜的指紋圖譜研究［5］，本實驗采用高效液相色譜法對中國林蛙卵油進行指紋圖譜研究，以期建立完整的指紋圖譜體系。中藥指紋圖譜技術作為全面控制中藥質量的有效手段已經得到廣泛的認同，中藥指紋學體系也日益完善。數字化指紋圖譜是利用數學原理或數學方法對指紋圖譜本質特征進行定義、表達、重組、模擬、信息挖掘等處理的系統加工過程［6］。本試驗采用HPLC法對中國林蛙卵油進行質量控制，建立中國林蛙卵油高效液相色譜數字化指紋圖譜，并采用系統指紋定量法對其進行質量評價，為中國林蛙卵油的全面質量控制提供一種新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑 Agilent 1100型液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器、低壓四元梯度泵、在線脫氣裝置、自動進樣器），ChemStation工作站（Agilent科技有限公司），RE52旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），Sarturius-BS110S分析天平（北京賽多利斯天平有限公司），KDM型控溫電熱套（山東鄄城華魯儀器公司）。乙腈（色譜純，山東禹王實業有限公司禹城化工廠），丙酮（分析純，康科德科技有限公司），磷酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑開發中心），亞油酸（供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所），水為去離子水。微孔濾膜（0.45 μm×25 mm，上海興亞凈化材料廠）。10批中國林蛙卵油均產自中國撫順（分別標注為S1～S10），采用CO2超臨界萃取而得，經沈陽藥科大學徐峰老師鑒定均為正品。

1.2 對照品溶液制備精密稱取亞油酸對照品102 mg，置25 mL量瓶中，加丙酮溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

1.3 供試品溶液制備精密稱取中國林蛙卵油1.50 g，置50 mL量瓶中，加適量丙酮超聲10 min使溶解，以丙酮定容至刻度，搖勻，放置12 h，過濾。精密量取濾液25 mL減壓蒸干丙酮，殘渣用流動相溶解并定容至25 mL，搖勻，過濾，作為供試品溶液，進樣前用0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.4 色譜條件色譜柱：大連江申CenturySIL C18BDS（250 mm ×4.6 mm，5 μm），乙腈-水-磷酸（80 ∶20 ∶0.15）為流動相。紫外檢測波長210 nm，柱溫（35.0±0.15）℃，進樣量 20 μL。

2 結果與討論

2.1 色譜條件選擇試驗中測試了沈陽辰陽Chromarex C18ODS（20 cm×4.6 mm，5 μm）和大連江申CenturySIL C18BDS（25 cm×4.6 mm，5 μm）兩種類型色譜柱；以205 nm、210 nm、220 nm、280 nm和320 nm為檢測波長進行試驗，考察了3種流動相系統（1）甲醇-水、（2）乙腈-水、（3）乙腈-水（含0.15%磷酸）；分別以丙酮、三氯甲烷、丙酮-流動相為溶劑提取供試品；根據色譜圖分離結果，決定采用丙酮和流動相系統處理樣品，選用大連江申CenturySIL C18BDS（25 cm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-水-磷酸（80∶20∶0.15）為流動相，選擇210 nm為檢測波長。

2.2 系統適用性試驗取樣品供試液20 μL進樣和亞油酸對照品1 μL進樣，記錄色譜圖，見圖1。比較保留時間可確定15.58 min為亞油酸，其與相鄰峰均達到基線分離，保留時間適中，可作為參照物峰。在此系統條件下，測得該峰的理論板數應不低于16 000。考察2 h基線和供試品2 h圖，結果系統無干擾且確定測定時間為30 min。

2.3 精密度試驗精密吸取S1號中國林蛙卵油樣品供試液20 μL，連續進樣5次，記錄色譜圖。以19號峰（亞油酸）的保留時間和峰面積為參照，計算各共有峰的相對保留時間RSD均小于1.0%；相對峰面積的RSD均小于3.0%。表明系統進樣精密度良好。

2.4 重復性試驗取S1號樣品平行制備5份供試液，精密吸取20 μL在HPLC儀上進樣并檢測，記錄色譜圖。以亞油酸峰的保留時間和峰面積為參照，結果各峰相對保留時間RSD均小于1.0%；相對峰面積RSD均小于3.0%。結果表明方法重復性良好。

2.5 穩定性試驗取S1號中國林蛙卵油供試液，分別在制備樣品后的0、4、8、12 h和16 h進樣測定，記錄色譜圖。計算各峰相對保留時間RSD均小于1.0%；相對峰面積的RSD除7號峰（RSD=3.81%）外，均小于3.0%，表明樣品在16 h內基本穩定。

2.6 中國林蛙卵油HPLC指紋圖譜建立將10批中國林蛙卵油供試液分別注入色譜儀，記錄色譜圖，見圖2。以19號峰（亞油酸）為參照物峰，按共有峰出現率100%計，確定共有峰為21個。將積分信號導入“中藥色譜指紋圖譜超信息特征數字化評價系統3.0”軟件［7］按平均值法計算生成對照指紋圖譜（RFP）見圖2。方向余弦平方cos2Y2+cos2Y13=0.59，表明2號峰與13號峰對SF貢獻為最大，起決定性作用。對照指紋圖譜特征技術參數見表1。

圖2 10批中國林蛙卵油HPLC指紋圖譜及RFP

2.7 中國林蛙卵油HPLC指紋圖譜超信息特征數字化評價［8］目前，中藥指紋圖譜的研究多停留在方法的研究，而建立方法后，對指紋圖譜的評價是指紋圖譜得到應用的重要一環。中國林蛙卵油HPLC指紋圖譜的評價采用孫國祥等開發的“中藥色譜指紋圖譜超信息特征數字化評價系統3.0”軟件，評價結果見表2。結果表明，本方法得到的指紋圖譜各指紋峰分離到基本達到基線分離（基線分離峰對兒數m、有效分離率β及ˉR分別為19～20、0.95～1.00及5.1～5.8），峰間等距性較好（分離度均化系數τ=0.811～0.840），有良好的信號均化性；峰面積參數（∑Ai、A_avg、A_geo）及平均峰高參數ˉH，表明個指紋峰信號較強。指紋峰柱效參數（W_avg、N）表明獲得較高柱效。F（指紋圖譜指數）=29.0～32.1，I（指紋圖譜信息量指數）=14.8～15.6，均表明中國林蛙卵油指紋圖譜絕對指數處于中等水平；Fr（指紋圖譜相對指數）=64.2～76.1，Ir（相對信息量指數）=31.0～36.3，比較可知Fr大于F而Ir大于I。對保留時間進行校正后得指數Fr（t）和Ir（t），二者與原Fr和Ir值相近，說明時間效率不突出；對進樣量進行校正后得指數Fr（q）和Ir（q），二者均高于原來F和I值，說明樣品所含化學信息量很高。綜合考慮，質控時，F、Fr、I和Ir應分別不低于29、62、14和31。

表1 中國林蛙卵油HPLC對照指紋圖譜特征技術參數

2.8 系統指紋定量法鑒定中國林蛙卵油質量［9］在對指紋系統定性分析合格基礎上，再對系統指紋進行整體定量分析，用Sm、Pm和α相結合來鑒定中藥質量的方法稱為系統指紋定量法。系統指紋定量法是對指紋系統的量化評價，具有較高實用性，可操作性更強的優點。其中Sm稱為宏定性相似度，Pm稱為宏定量相似度，兩者能夠整體監測化學指紋整體含量；指紋均化性變動系數用相對標準偏差α表示。以對照指紋圖譜為評價標準，分別計算10批中國林蛙卵油的Sm、Pm和α并判定其質量，見表3。樣品中S7和S10質量級別為極好，其余批次均為很好。

2.9 中國林蛙卵油統一化HPLC指紋圖譜［10-11］為增強指紋圖譜的通用性和實用性，實現同類型色譜在相同實驗條件下，采用不同儀器檢測系統而獲得的分析結果的直接比對，本實驗應用孫國祥等研發的“中藥色譜指紋圖譜超信息特征數字化評價系統3.0”對圖譜進行了統一化參量評價，建立了中國林蛙卵油統一化HPLC指紋圖譜指數圖譜，相對統一參數見表4，圖譜見圖3，從多維數字化角度揭示了與中國林蛙卵油相關的RP-HPLC指紋圖譜的特征，為采用其它儀器系統所得的指紋圖譜的評價提供了依據。色譜指紋圖譜定信號指數Ft/a是將各指紋峰均視為最大峰（均化系數γ=1），有效分離率和峰等距性都為最佳時ra統一化相對積分和B值（與和 ξ很相關），從總體上反映各指紋峰rai=1時rti擴展程度大小，；Fα/t是用來考察當各峰都定點于最末峰位置且有效分離率、信號均化性為最佳時需要V增大的程度（與V具有最大相關性），Ft/a和Fα/t值均越小越好。結果顯示，兩者均以S3最小，表明其圖譜達到理想狀況最容易，原指紋圖譜最理想。