亨廷頓舞蹈病的臨床特點與基因診斷（附一個家系報告）

亨廷頓舞蹈病又稱亨廷頓?。℉untington's disease，HD）、慢性進行性舞蹈病，是一種影響運動功能為主的神經退行性疾病，以基底節及大腦皮層神經元缺失為基本病理特征。IT15（interesting transcript 15）基因是HD的致病基因，定位于4p16.3，是由于該處外顯子1的CAG重復序列的異常擴展突變引起［1］。我們收集了湖北一個臨床擬診為亨廷頓舞蹈病的家系，采用DNA直接測序方法檢測IT15，以提供遺傳咨詢以及探討IT15基因中CAG的重復拷貝數與發病年齡、臨床特征之間的關系并綜述亨廷頓舞蹈病治療的最新進展。

1 資料與方法

1.1 對象

一經臨床擬診為 HD家系（圖 1），對該家系進行詳細的臨床病史調查并盡可能全面收集患者的臨床資料包括實驗室檢查、腦電圖、頭顱CT、MRI和簡易智力狀態量表（mini-mental state examination，MMSE），都經過臨床檢查排除了其他內外科疾病。按知情同意和自愿參與原則，該家系中有11名成員參與（包含2名有癥狀成員）。

1.2 研究方法

1.2.1 提取 DNA 采集肘靜脈血 4 mL，應用DNA提取試劑盒提取外周血白細胞基因組DNA，DNA提取試劑盒購于上海賽百盛基因技術有限公司。

1.2.2 PCR擴增 ①上游引物序列（t15f）：CCCAGAGCCCCATTGATTGCC；下游引物序列（t15r）：GGCGGCGGTGGCGGCTGTTGC，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；②以受試者外周血白細胞基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應體系為10X的PCR緩沖液（含Mg2＋）5μL，2.5mM的dNTPs4μL，10μM引物t15f和t15r各2μL，基因組DNA（100ng／μL）4μL，5U／μL的熱啟動TaqDNA聚合酶（TAKARA）0.5μL，加水補足50μL；③應用9700型自動擴增儀（美國ABI公司）進行擴增反應，反應條件為預變性94℃，8min，（94℃，30s；64℃，30s；72℃，30s）為1個循環，共40個循環，最后72℃，延伸5min。

圖1 HD家系圖譜，即先證者

1.2.3 電泳 將PCR擴增產物各取5μL進行2％瓊脂糖電泳檢測。

1.2.4 基因測序 將PCR產物直接測序，測序引物采用t15f，并對有明顯雙特異性條帶的擴增產物，進行切膠純化后測序。

2 結果

2.1 臨床特點 該家系共28人（家系圖譜見圖一），6例患者，男3例，女3例，首發年齡在35～71歲，平均54.3歲；已逝的3例患者病程9～15年，平均11.3年。呈父系遺傳，第Ⅰ代起病年齡71歲，第Ⅱ代平均起病年齡59歲，第Ⅲ代平均起病年齡39歲：先證者46歲，43歲時出現輕微左肩聳動，目前已進展至吐詞欠清，雙肩聳動，左側肢體不自主運動，以上肢為主。神經系統查體主要為四肢肌張力低，四肢腱反射活躍，雙上肢Rossolimo′s和Hoffman′s 征（＋），雙下肢踝陣攣（＋），指鼻和跟膝脛試驗完成不協調。家屬訴其記憶力下降，暴躁易怒伴抑郁傾向，表現為語言減少，不愛活動。Ⅱ9：62歲起病，病程已10年，起初表現為一側腿抬高，逐漸進展為全身不自主運動伴認知障礙，目前查體：不能行走，神清，計算力下降，反應遲鈍，嚴重構音障礙，吞咽困難，不自主吐舌頭，嘴角牽動，全身不自主運動，雙手徐動，全身肌肉重度萎縮，四肢肌力V級，四肢肌張力高，四肢腱反射減弱，指鼻和跟膝脛試驗不能，家屬訴患者性格固執，舞蹈樣動作減少；據家屬介紹Ⅰ1和Ⅱ3與Ⅱ9臨床表現類似，Ⅱ3病歷中記載病程中服用氟哌啶醇和安坦片期間曾有好轉，最終因呼吸循環衰竭死亡；Ⅱ1起初表現為雙肩聳動，雙上肢扣扣子樣不自主動作，病情發展也與Ⅱ9類似；Ⅲ5：35歲起病，以雙下肢抖動為主，不倒地。

2.2 主要實驗室特征 先證者腦電圖檢查未見明顯異常；Ⅱ3病歷中記載頭顱CT、MRI示腦萎縮；Ⅱ9MMSE評分小于10分。

2.3 電泳結果 2例已發病患者（Ⅱ9和Ⅲ4）和1例無癥狀成員（Ⅳ1）均有特征性兩條擴增帶，一條含正常（CAG）n重復數，約220bp，另一條含異常擴展的（CAG）n重復，約300bp左右；余8名成員只顯示一條擴增帶，約220bp（圖2）。

2.4 基因測序 對所有成員的PCR產物直接測序，其中對有明顯雙特異性條帶的擴增產物，進行切膠純化后測序；3名成員CAG重復數目大于等于40：Ⅱ9為17／40，Ⅲ4為17／45，Ⅳ1為16／48，其他8名成員CAG重復數目在20次以下。具體見圖3和表1。

圖2 PCR后電泳結果注：Marker：50 bp梯度相對分子質量標準；Ⅲ4和Ⅱ9為有癥狀患者，Ⅳ1為癥狀前患者，余為健康成員

表1（CAG）n與起病年齡和臨床表現之間的關系

3 討論

亨廷頓舞蹈病多中年起病，以慢性進行性舞蹈樣動作、認知障礙和精神行為異常三聯征為典型特點，呈遲發型常染色體顯性遺傳的神經變性疾病，一般病程在15～20年左右［2］，臨床上頭顱CT和MRI提示基底節區腦萎縮，無特異性，確診須靠IT15基因檢測。國外通過對歐美大樣本人群IT15基因檢測分析得出［3］：CAG重復數≤26時未發現引起疾??；在27～35時未發現引起疾病，但可引起突變，在減數分裂時不穩定，易發生擴展突變，尤其是父系遺傳時；在36～39時為不完全外顯的HD等位基因，攜帶者可能發病也可能不發病，≥40時為完全外顯的HD等位基因，攜帶個體必然會患病。我們收集的這個家系起病年齡平均54.3歲，舞蹈樣動作逐漸加大，其中4例晚期伴智能障礙、性格固執和脾氣暴躁，基因測序結果顯示有癥狀的2例患者CAG重復數目大于40；IT15基因檢測結果為雜合子，結合家系圖譜中代代遺傳，中年起病的特點表明該家系呈遲發型常染色體顯性遺傳，故可明確診斷該家系疾病為亨廷頓舞蹈病。其中Ⅳ1為女性12歲，目前無任何臨床表現，但電泳顯示特征性兩條擴增帶，基因測序CAG重復數目大于40，我們稱之為癥狀前患者，該患者必然發病，但起病時間目前不能確定，并有50％的可能將IT15基因遺傳到下一代，故將來孕早期建議行產前診斷。

通過家系圖譜，我們可以看出該家系呈父系遺傳，且每代發病年齡較上代提前，體現出遺傳早現的特點，這與國外報道一致［4］；有文獻報道，（CAG）n重復越多，發病越早，累計50％～70％的符合這個規律［5］，其他不符合的情況可能與基因變異和環境有關；但（CAG）n重復長度與病情進展的速度無顯著的關聯［6］，在我們收集的這個家系里，Ⅱ9CAG重復40次，62歲發?。虎?，45次，43歲發病，一定程度也提示了發病年齡與CAG重復數呈負相關。Ⅳ1，48次，目前未發病，其發病年齡有待觀察；這3例結果也提示隨著年齡的增加，逐漸表現出癥狀，可能與IT15基因表達的亨廷頓蛋白聚集有關。有學者提出HD的發病年齡可能與MSX1基因［7］、ApoE基因［8］、ADORA2A［9］基因或Atg7基因上的V471A的多態性［10］等有關。

目前關于HD的治療，致力于減慢疾病進展，藥物均處于試驗性階段，仍未發現特異性藥物［11］。目前輔酶Q10［12］、利魯唑［13］、艾斯能［14］以及肌酸［15］這四種藥物有研究報道在治療HD有一定療效，但仍需長時間大樣本的隨機對照試驗證實，其中輔酶Q10和肌酸已進入臨床試驗Ⅲ期。有學者認為HD非常適合作為神經保護藥物的模型，可能推遲甚至阻止其臨床表現的發生［16］。提倡HD從無癥狀階段開始干預可能對預后有利，HD治療前景還是很樂觀的［2］。

致謝：感謝潘松青教授對我的課題指導和論文修改，感謝這個家系成員的合作，感謝夏莉，梁靜靜幫助我收集資料，感謝北京尤比愛生物科技中心楊福輝對我們收集的家系成員DNA進行基因測序。

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