促腎上腺皮質激素釋放激素受體1基因多態與抗抑郁藥物療效的關聯研究☆

下丘腦－垂體－腎上腺（Hypothalamic-Pituitary-Adrenocortical，HPA）軸功能亢進是抑郁癥常見的神經內分泌改變［1］，與抑郁癥的發病機制、病情進展及治療均密切相關［2］，反映了下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素（Corticotropin-releasing Hormone，CRH）調節功能的異常［3］。研究表明，多種抗抑郁藥均可減少抑郁癥患者和健康人的CRH基因表達及抑制HPA軸活性［4］。一些臨床試驗提示抗抑郁藥療效與促腎上腺皮質激素釋放激素受體1（corticotropin-releasing hormone receptor1，CRHR1）相關［5－6］，但也有對該相關性的陰性報道［7－8］。目前在國內有關CRHR1基因多態的相關研究并不多，故本研究對中國漢族抑郁癥患者CRHR1基因多態是否與選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑（Selective Serotonin Reuptake Inhibitors，SSRIs）及 5-羥色胺和去甲腎上腺素再攝取抑制劑（Serotonin and Norepinephrine Reuptake Inhibitors，SNRIs）療效相關進行探討。

1 對象和方法

1.1研究對象 均來自2005年12月至2007年4月就診于上海市精神衛生中心門診的抑郁癥患者。入組標準：①符合美國精神障礙診斷與統計手冊第4版（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，Fourth Edition，DSM-Ⅳ）抑郁癥診斷標準；②年齡18～65歲；③漢密爾頓抑郁量表17項（Hamilton Depression Scale-17，HAMD-17）≥18 分；④漢族；⑤最近4周內未服用過任何抗抑郁藥或長效的抗精神病藥物，6個月內未接受過電抽搐治療。排除標準：①合并明顯的軀體疾病、神經系統疾病和其他精神障礙；②其他器質性原因或藥物引起的繼發性抑郁障礙；③嚴重肝腎代謝功能異常；④妊娠期或哺乳期婦女。共入組271例患者，其中男111例，女 160 例，均為漢族，年齡 18～ 65 歲，平均（36.1± 12.9）歲，病程 3周～44 年，中位數 15個月，首次發病患者占48.3％，HAMD-17為18～35分，平均（23.35±3.57）分。所有研究對象均對本研究知情同意并簽署知情同意書。本研究獲得上海交通大學醫學院附屬精神衛生中心倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1 臨床治療 患者入組后給予SSRIs（西酞普蘭、帕羅西汀、氟西汀和依地普侖）或SNRIs（度洛西汀、去甲文拉法辛）中的一種進行足量治療，觀察6周。

1.2.2 療效評定 在入組時、治療4周和6周后分別采用HAMD-17評估患者病情。評定人為經案例評估合格的主治及主治以上精神科醫師完成，一致性檢驗的 Kappa值為 0.87。將治療 6周后HAMD-17總分減分率≥50％界定為有效，HAMD-17總分減分率＜50％為無效，減分率＝（基線總分－治療第6周末總分）／基線總分×100％。

1.2.3 基因型檢測 入組時采集患者靜脈血5 mL全血置于15 mL的離心管（內有1 mL 2％EDTA抗凝劑）中混勻，置于4℃的冰箱內保存，于抽血1周內用酚氯仿法提取 DNA。從 HapMap（http：／／www.hapmap.org）數據庫上下載中國漢族人群（CHB）分型數據，根據最小等位基因頻率（MAF）＞0.05，連鎖不平衡系數（r2）＞0.8的原則挑選單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP），共 選 取CRHR1基因的4個SNPs位點，分別為rs17689966、rs4458044、rs12953076、rs242924。使用 TaqmanMGB探針法在384孔ABI Prism 7900檢測系統（Applied Biosystems，CA）上進行定量PCR擴增對上述4個SNP在271例樣本中進行基因型分型。4個位點的探針均在美國ABI公司定制（序列號分別為rs17689966：C＿25993166＿10 ；rs4458044 ：C＿26971929＿10 ；rs12953076：C＿478237＿10；rs242924：C＿2257689＿10）。PCR擴增總體系為 5 μL，包括 Taqman Universal PCR Mastermix 2.5 μL，Taqman Probe 0.04 μL，DNA模板 2.4 μL。PCR 擴增條件：95℃ × 10 min；然后92℃ × 15 s，60℃×1 min，45 個循環。使用 SDS version 2.1 軟件（applied biosystems）進行數據處理。

1.3 統計學方法 采用 SAS 9.13和 SNPstats在線軟 件（http：/／bioinfo.Iconcologia.net／snpstats／start.htm）進行數據的統計分析。用多因素非條件Logistic回歸分析校正混雜因素；χ2吻合度檢驗分析單位點基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡法則；χ2檢驗用于比較有效組和無效組之間基因型分布及等位基因頻率。運用Haploview 4.1軟件檢驗各位點間的連鎖不平衡程度，構建單倍域進行單倍型分析，采用窗口移動方式（sliding-window）對所有連續的、D’＞0.65的 2～3個 SNPs組合所構成的單倍型與藥物療效的相關性進行分析。統計學顯著性水平設為P＜0.05。

2 結果

2.1 臨床治療結果

2.1.1 治療 4周末結果 完成 4周治療的患者233例，脫落38例。達到臨床有效標準136例（男51例，女85例），無效 97例（男 45例，女 52例），有效率58.4％。有效組和無效組間性別、年齡的差異均無統計學意義（χ2＝0.01，P＞0.05；t＝0.82，P＞0.05）。

2.1.2 治療 6周末結果 完成 6周治療的患者230例，脫落41例。在治療觀察結束時，達到臨床有效標準182例（男69例，女113例），無效48例（男26例，女22例），有效率79.1％。有效組和無效組間性別、年齡的差異均無統計學意義（χ2＝0.02，P＞0.05；t＝0.85，P＞0.05）。

2.2 CRHR1基因4個SNPs位點平衡性檢驗 經χ2檢驗CRHR1基因4個SNPs位點均符合Hardy-Weinberg 平衡（χ2值分別為 3.46、0.12、0.04、0.81，均 P＞0.05），見表 1。

2.3 臨床療效與CRHR1基因獨立候選位點多態性的關聯分析 第4周末時，有效組和無效組之間rs17689966位點的等位基因及基因型頻率的差異有統計學意義。其中，rs17689966位點攜帶有A等位基因的抑郁癥患者的治療有效率顯著低于G等位基因攜帶者（χ2＝8.13，P ＝0.004）；基因型 AA攜帶者在治療第4周中也表現出較明顯的無療效反應，這種危險性是非攜帶患者的1.98倍（χ2＝10.81，P ＝0.004）；在 6 周末，該位點不同等位基因患者的差異有顯著性趨勢（χ2＝3.33，P ＝0.066），但未達統計學意義。其余各SNPs位點的不同基因型間4周末和6周末的有效率差異均無統計學意義（均 P＞0.05），見表 2。

表1 CRHR1四個SNPs的Hardy-Weinberg平衡檢驗結果

表2 CRHR1各SNP等位基因及基因型與抗抑郁藥療效的關聯分析（經性別、年齡較正n％）

2.4 臨床療效與CRHR1基因候選位點單倍型的關聯分析 CRHR1的4個SNP位點連鎖不平衡分析見圖1。在4個位點中，rs4458044與rs242924之間 D’＝1.00，rs242924與 rs17689966之間 D’＝0.68，rs4458044、rs242924 和 rs17689966 兩 兩 之間D’均＞0.68，呈較強連鎖不平衡。在用藥4周末時，rs242924-rs17689966攜帶T-A單倍型的抑郁癥患者治療有效率高于非T-A攜帶者（χ2＝8.08，P＝0.002），而攜帶T-G者的藥物療效反應較差χ2＝6.00，P ＝0.018），差異均有顯著的統計學意義。攜帶單倍型 G-T-G（rs4458044-rs rs242924-rs17689966）患者的臨床有效率明顯低于非G-T-G攜帶者（χ2＝6.31，P ＝0.019），見表 3。其余構成各單倍型的不同基因型間，在藥物治療4周末和6周末的臨床有效率的差異無統計學意義（均P＞0.05）。

表3 CRHR1單倍型與4周末抗抑郁藥療效的關聯分析

圖1 CRHR1tagSNPs

3 討論

在HPA軸中，CRH與腺垂體前葉促皮質素細胞上的 CRH 受體（CRH receptor，CRHR）結合，通過增加細胞內的環磷酸腺苷與Ca2＋從而促進促腎上腺皮質激素的釋放［9］。CRH的生物學效應主要由2個受體亞型介導，即CRHR1和CRHR2型。CRHR1和CRHR2廣泛分布于與情感相關的腦區，如腦干、邊緣系統和皮質等，其中，CRHR1在邊緣系統及垂體上的分布占主導地位，并且，在協調HPA軸對應激的反應及下丘腦外的應激相關行為時，CRHR1發揮了關鍵作用［10］。此外，CRH 系統與多種神經遞質通路相關聯，與去甲腎上腺素、谷氨酸和5-羥色胺（5-HT）能神經纖維聯系密切。最近的一項研究證實，CRH可通過CRHR1的內化及再循環機制提高細胞表面的5-HT2a受體表達水平，進而調節5-HT2a受體的信號轉導通路，引發5-HT水平的改變，產生焦慮及抑郁樣行為［11］。而一直以來5-HT的水平被認為與抑郁癥的治療效應直接密切相關。以上證據均支持了CRHR1與抗抑郁藥療效可能相關。Ising等［4］提出抗抑郁藥可能的共同效應是最終都使得異常的CRHR信號途徑正常化。

本研究對CRHR1基因多態性與抗抑郁藥療效的相關性進行了探討。關聯分析結果顯示，治療4周rs17689966位點的基因型分布及等位基因頻率均與SSRIs、SNRIs療效相關。但在治療第6周時，該位點等位基因頻率在療效中的差異只是有顯著性趨勢，而不再具有統計學意義，提示rs17689966位點多態可能僅與抗抑郁藥的早期顯效相關。然而，該結果也可能與樣本量不足有關，6周末該位點在不同療效組間的差異仍是有顯著性趨勢的，因此擴大樣本量后該差異或許就會具有顯著的統計學意義。單倍型關聯分析表明，治療4周末單倍型 T-A（rs242924-rs17689966）對抗抑郁藥反應較好，而在6周末該差異則不再具有統計學意義，提示該單倍型具有早期顯著的抗抑郁療效。與此同時，治療4周末單倍型 T-G（rs242924-rs17689966）和 G-T-G（rs4458044-rs rs242924-rs17689966）與抗抑郁藥的臨床有效率低關聯，而6周末不再有此種關聯，故提示攜帶T-G或G-T-G單倍型的抑郁癥患者不易獲得早期的臨床療效。本研究有關CRHR1基因單位點及單位點組成的單倍型與抗抑郁藥療效相關的結果與既往一些研究結果一致［5－6］。Licinio等［5］在233例墨西哥抑郁癥人群中發現CRHR1基因的單倍型GAG（rs1876828-rs242939-rs242941）與伴焦慮的抑郁癥患者應用氟西汀或去甲丙咪嗪的抗抑郁療效相關。隨后，我國Liu等［6］以127例中國漢族抑郁癥患者為研究對象（服用氟西汀）重復了上述研究，得到基本一致的結果，另外還發現rs242941位點G／G基因型也與藥物療效相關。然而，與本研究結果相反，另外一項以159例西班牙抑郁癥患者為對象的研究未發現 CRHR1多態（rs110402，rs242937）與西酞普蘭療效的關聯［7］；Binder 等［8］以 STAR*D 的 1953 名抑郁癥患者為研究對象，對CRHR1基因上19個標簽SNPs（未列出）進行了分析，經多重檢驗校正后也未發現與西酞普蘭療效顯著相關的位點，其原因可能與種族差異、研究設計的不同及抽樣誤差等有關。

綜上所述，本研究顯示CRHR1基因與SSRIs及SNRIs療效的差異存在相關性，支持既往研究的一些結果［5－6］，但本研究也有一定的局限性 。首先，有些可能影響治療效果的因素未討論，例如，抑郁與焦慮的共病情況很普遍，先前的一些研究也顯示CRHR1基因多態性可能與抑郁伴焦慮患者的藥物療效相關［6］。本研究選擇了分屬兩大類（SSRIs、SNRIs）的多種抗抑郁藥，雖然早有研究顯示不同的抗抑郁藥最終的治療效果是沒有顯著差異的［12］，但 SSRIs和 SNRIs療效或許與納入的SNPs有不同的相關性，因此這種異質性的存在也可能會影響研究結果。其次，缺少對脫落患者的分析，而這部分資料也許會干擾統計效能，故以后的研究有必要增加這部分患者的臨床資料及基因型分析。另外，本研究盡管發現rs17689966與抗抑郁藥的療效相關，但因該位點是位于CRHR1基因的內含子區域，不直接影響基因的表達，故也可能是其它與該位點緊密連鎖的功能位點才是與治療相關的真實位點。最后，本研究未檢測患者治療前后血漿中CRH的變化水平，故沒能從宏觀角度驗證CRHR1基因SNP多態與CRH水平是否直接相關。因此本研究僅為初步結果，今后有待于更多臨床試驗的進一步深入研究。

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