K562細胞過表達MHCⅠ類相關抗原A對樹突狀細胞吞噬功能的影響

張 躍,邵小青,陳 貝,季明春,龔衛娟

(揚州大學醫學院病原生物學和免疫學教研室,江蘇揚州,225001)

MHC I類相關抗原A(MICA)是細胞受到應激反應后在其表面表達的一種蛋白。MICA受體為表達于 NK 、NKT 、CD8+T 、γ δ T 等細胞表面的活化性受體NKG2D。當NKG2D與其配體結合后,主要通過與其偶聯的轉接蛋白DAP10傳遞活化信號,是介導細胞毒功能的關鍵蛋白[1]。近來研究[2-3]發現,MICA具有介導NK細胞與DC之間相互作用的活性,MICA陽性表達的腫瘤細胞易被NK細胞攻擊而進入凋亡狀態。因此,本文試圖觀察腫瘤細胞過表達MICA抗原時,被誘導形成的凋亡小體對DC吞噬活性的影響。該研究將深入揭示使用某些化學藥物誘導腫瘤細胞凋亡或上調MICA抗原表達時,不僅直接影響天然免疫功能,且因具有調節DC的活性繼而對獲得性免疫功能產生影響[4-5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重組pcDNA3.1-MICA表達載體由本室自行構建并保存[4],紅白血病細胞株K562,單核細胞株THP1均來自美國ATCC,由本室常規保存。外周血淋巴細胞分離液購自挪威Axis-shield公司。RPMI1640培養基購自Invitrogen公司。胎牛血清購自杭州四季青公司,G418、青霉素、鏈霉素、兩性霉素B購自上海生工生物公司。絲裂霉素C來自Sigma公司。脂質體轉染試劑盒lipofectamine 2000購自 Invitrogen公司。重組人GM-CSF、IL-4購自 PeproTech公司。FITC-抗-CD14mAb,APC-抗-CD11cmAb,PE-抗-MICA mAb,PE-抗-HLA-DR mAb,PE-Cy5-抗-CD86 mAb,PE-抗-NKG2D mAb,NKG2D中和性抗體均購自Biolegend或eBioscience公司。CFSE細胞染色試劑盒來自 Invitrogen公司。流式細胞儀FACS Arial來自Becton Dickinson公司。

1.2 穩定表達MICA抗原的K562細胞株的建立

無菌條件下抽提質粒,按照Invitrogen公司的說明書進行操作,具體過程為:取對數期的K562細胞置于24孔內,共10孔。取 16 μ g的質粒用質粒稀釋液稀釋至總量400 μ L,取32 μ L的脂質體用無血清培養基稀釋至總量400 μ L,2者混合,室溫孵育10 min,每孔加入100 μ L的復合物,另外兩孔作為陰性對照。37℃,5%CO2培養4 h后加入全培養基,48 h后加入G418篩選。2周后篩選出G418抗性的細胞。對篩選出的細胞用PE-MICA抗體標記,進一步用流式細胞術分選,得到純度>90%的K562-MICA細胞。

1.3 流式細胞術檢測THP1細胞的表型

分別取對數期培養的K562和K562-MICA細胞,用絲裂霉素 C(30 μ g/mL)37 ℃處理3 h,全培養基洗滌3遍。按1︰1比例與THP1細胞孵育過夜。收集混合培養的細胞,分別標記CD14和CD86、MICA、HLA-DR 和NKG2D 的抗體,流式細胞儀分析CD14陽性細胞內各細胞表面分子的表達。

1.4 DC的體外誘導

常規分離外周血單個核細胞(PMBCs),計數并調整細胞的密度為2×106/mL。將細胞鋪于24孔板中培養(每孔500 μ L,約 1×106個細胞/孔),37℃,50 mL/L CO2條件下培養過夜。次日去掉未貼壁的細胞,加新鮮培養基,并加細胞因子GM-CSF(100 ng/mL)和IL-4(40 ng/mL)繼續CO2培養。隔日半量換液,培養5 d,誘導為未成熟DC。

1.5 DC對腫瘤細胞凋亡小體的吞噬

分別取對數期培養的K562、K562-MICA細胞株,懸浮于1 μ L 5 mmol/L的CFSE,37 ℃孵育10 min,5倍體積全培養基洗滌終止反應。CFSE標記的細胞用絲裂霉素C(10、30 μ g/mL)處理37℃孵育3 h后,經全培養基洗滌后與未成熟DC按3∶1比例孵育過夜。次日混合細胞懸液用CD11c抗體或HLA-DR抗體標記,流式細胞儀檢測CD11c+CFSE+細胞或 HLA-DR+CFSE+細胞,計算CD11c+CFSE+細胞或HLA-DR+CFSE+細胞頻率占總CFSE陽性細胞的頻率,(Q2/Q1+Q2)×100%代表吞噬率。

2 結 果

2.1 K562-MICA細胞的鑒定

K562-MICA細胞的熒光強度顯著增強,說明MICA抗原已經穩定表達在K562細胞表面(圖1)。

2.2 凋亡的K562-MICA細胞對THP1細胞相關表型的影響

在確定 THP1表達CD14和CD11c細胞表面標記的基礎上(圖2),觀察THP1細胞表面CD86、MICA、HLA-DR、NKG2D 表達的變化。結果顯示,K562細胞刺激可微弱上調 CD86、MICA、HLA-DR和NKG2D的表達。但與K562相比,K562-MICA細胞可刺激THP1上調CD86、MICA的表達,且CD86和MICA陽性的細胞頻率近2倍增長,而對HLA-DR、NKG2D的表達無明顯影響(圖3)。本實驗重復2次。

圖1 流式細胞術檢測MIC A在K562細胞的表達

圖2 THP1細胞高表達CD14和CD11c

圖3 K562-MICA細胞刺激THP1上調表達 CD86和 MICA

2.3 K562-MICA細胞的凋亡小體對THP1細胞吞噬功能的影響

本實驗首先將K562、K562-MICA細胞經熒光素CFSE標記,進而用絲裂霉素C處理誘導凋亡,2者混合過夜后檢測CD11c+CFSE+細胞的頻率代表THP1細胞對凋亡小體的吞噬活性。結果發現,來自 K562-MICA的凋亡小體更容易被THP1細胞吞噬(圖4)。

2.4 來自K562-MICA細胞的凋亡小體對DC吞噬功能的影響

與K562細胞相比,來自K562-MICA細胞的凋亡小體更容易被 DC吞噬,且 DC內吞噬的CFSE碎片熒光強度降低,提示這些碎片進入DC胞漿內已被及時加工處理[6](圖5)。

圖4 來自K562-MICA的凋亡小體促進THP1細胞吞噬

圖5 來自K562-MIC A細胞的凋亡小體易被DC吞噬

2.5 DC對K562-MICA細胞凋亡小體的吞噬依賴NKG2D受體

盡管凋亡狀態的K562細胞可上調DC表達NKG2D受體,但MICA在K562細胞表達后可協同刺激NKG2D的上調表達,尤其在細胞凋亡程度(絲裂霉素C 30 μ g/mL)較為明顯時,MICA 的協同作用亦較為明顯(圖6)。在此基礎上,作者在DC與凋亡細胞的懸液中加入人NKG2D的中和性抗體,結果顯示,NKG2D抗體可拮抗DC對K562-MICA細胞凋亡小體的吞噬作用(P<0.05),但并未下降到對K562細胞的水平,提示DC表面可能還有其他受體參與吞噬作用[7](圖7)。

圖6 K562-MICA細胞刺激DC上調表達NKG2D受體

圖7 NKG2D抗體拮抗DC對K562-MICA細胞凋亡小體的吞噬活性

3 討 論

本研究初步揭示了某些化學藥物(如柔紅霉素、硼替佐米等)治療腫瘤的分子機制,因為這些藥物在誘導腫瘤細胞凋亡的同時促進細胞表面表達MICA抗原。DC吞噬腫瘤細胞凋亡小體的意義不僅僅在于清除細胞碎片,更重要的是將腫瘤細胞來源的特異性抗原遞呈給T細胞,誘導免疫記憶的產生,從而達到根治腫瘤的目的。

NKG2D的配體除MICA抗原,還包括MICB和ULBP1～6分子。小鼠NKG2D還可識別視黃酸早期誘導蛋白-1(RAE-1),次要組織相容性抗原(H60)和鼠ULBP樣轉錄子(MULT-1)?；贜KG2D配體表達譜的研究已證實,80%的上皮性腫瘤細胞表達MICA,而血液細胞來源腫瘤表達NKG2D的另一配體(ULBP)。然而由于免疫選擇的壓力(即免疫細胞清除MICA抗原高表達的細胞),晚期腫瘤細胞表面MICA表達往往逐漸降低或丟失,造成免疫細胞不能識別腫瘤[8]。因此,通過某些化療藥物或基于MICA高表達的基因疫苗來提高腫瘤細胞表達MICA的密度,可作為腫瘤免疫治療的手段之一。

K562-MICA細胞來源的凋亡小體可明顯促進DC表達NKG2D,而THP1細胞表面NKG2D的表達卻沒有明顯變化。作者推測一方面可能與兩種細胞處于分化的不同階段有關,THP1處于早期的單核細胞階段;另一方面,THP1為發生惡性轉化的腫瘤細胞,與機體內正常細胞的生物學特征不完全一致。NKG2D一直被認為僅表達于淋巴細胞,但最近研究發現,DC或巨噬細胞在某些條件下可表達NKG2D。Baba等[9]報道大鼠體內CD4+CD8+巨噬細胞可表達NKG2D,通過識別腫瘤細胞表面MICA抗原而發揮抗腫瘤活性。Buhtoiarov等[10]發現小鼠初始巨噬細胞與L5178Y淋巴瘤細胞株及內毒素(LPS)共孵育后上調NKG2D受體的表達。K562-MICA細胞促進DC上調NKG2D表達的機制,推測可能與凋亡小體表面的危險信號(包括MICA抗原)分別與DC表面相關受體(如清道夫受體、DEC-205、TLR、NKG2D)結合,誘導DC活化有關。但在誘導NKG2D表達的刺激信號中,哪一種信號發揮關鍵作用,仍然需要深入研究。

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