調(diào)肝止痛膠囊的質(zhì)量標準研究

鄭琰，王芳，談靜，曾倩（.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都 6007；.成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 6007）

調(diào)肝止痛膠囊是由白芍、丹參、枳殼和沒藥等8味藥材組成的中藥復(fù)方制劑，具有養(yǎng)血益肝、行氣活血、祛瘀止痛的功效，在臨床上用于治療肝郁血瘀型痛經(jīng)。筆者對方中白芍、丹參、枳殼和沒藥進行薄層色譜（TLC）鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法測定了方中主藥白芍有效成分芍藥苷的含量，建立了調(diào)肝止痛膠囊的質(zhì)量標準，為該制劑的質(zhì)量控制提供了簡單、快速、可靠的方法。

1 儀器與試藥

1100 HPLC儀，包括1100系列二級泵、二極管陣列檢測器、化學(xué)工作站（美國Agilent公司）；BP211D分析天平（德國Sartorius公司）；SB3200超聲波清洗機（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，功率:280 W，頻率:40 kHz）；ZF-90暗箱式紫外透射儀（上海顧村電光儀器廠）。

芍藥苷、丹參酮ⅡA、柚皮苷對照品（供鑒別用，批號分別為110736-200933、110726-200518、110722-200610），白芍、丹參、枳殼、沒藥對照藥材（供鑒別用，批號分別為120905-200508、120923-200610、120981-200403、121250-200503），芍藥苷對照品（供含量測定用，批號:110736-200933）均由中國食品藥品檢定研究院提供；調(diào)肝止痛膠囊（批號:20100301、20100302、20100303）及其相應(yīng)陰性樣品（批號:20100311、20100312、20100313、20100314）均由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供；硅膠G（青島海洋化工廠）；乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別[1，2]

2.1.1 白芍的TLC鑒別 取本品內(nèi)容物1 g，加乙醇10mL，超聲處理30min，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加乙醇1mL使溶解，作為供試品溶液；取白芍對照藥材0.5 g和陰性樣品1 g，同法分別制成對照藥材溶液和陰性對照溶液；另取芍藥苷對照品適量，加乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。照TLC法[2]試驗，吸取上述4種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品、對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍紫色斑點；陰性對照無干擾。白芍的TLC見圖1。

2.1.2 枳殼的TLC鑒別 取本品內(nèi)容物0.7 g，加甲醇10mL，超聲處理30min，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加甲醇5mL使溶解，作為供試品溶液；取枳殼對照藥材0.2 g和陰性樣品0.7 g，同法分別制成對照藥材溶液和陰性對照溶液；另取柚皮苷對照品適量，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。照TLC法[2]試驗，吸取上述4種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶6∶2）下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，于105℃加熱約5min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品、對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性對照無干擾。枳殼的TLC見圖2。

圖1 白芍的TLC1.對照品；2.對照藥材；3～5.供試品；6.陰性對照Fig 1 TLC of Paeonia lactiflora1.substance control；2.reference substance；3～5.test samples；6.negative control

2.1.3 丹參的TLC鑒別 取本品內(nèi)容物3 g，加乙醚5mL，振搖，放置1 h，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作為供試品溶液；取丹參對照藥材1 g和陰性樣品3 g，同法分別制成對照藥材溶液和陰性對照溶液；另取丹參酮ⅡA對照品適量，加乙酸乙酯制成每1mL含2mg的溶液，作為對照品溶液。照TLC法[2]試驗，吸取上述4種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（17∶3）為展開劑，展開，取出，晾干，日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品、對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾。丹參的TLC見圖3。

2.1.4 沒藥的TLC鑒別 取本品內(nèi)容物10 g，加乙醇50mL，超聲15min，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加乙醇5mL使溶解，作為供試品溶液；取沒藥對照藥材0.2 g和陰性樣品10 g，同法分別制成對照藥材溶液和陰性對照溶液。照TLC法[2]試驗，吸取上述3種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯（17∶3）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾。沒藥的TLC見圖4。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗[2]色譜柱:Hypersil ODS-C18（150mm×4.6mm，5.0μm）；流動相:乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）；流速:1.0mL·min－1；柱溫:20 ℃；檢測波長:230 nm；進樣量:10μL。理論板數(shù)按芍藥苷色譜峰計算應(yīng)不低于2000。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷對照品5.75mg，置50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

圖2 枳殼的TLC1.對照品；2.對照藥材；3～5.供試品；6.陰性對照Fig 2 TLC of Citrus aurantium1.substance control；2.reference substance；3～5.test samples；6.negative control

圖3 丹參的TLC1.對照品；2.對照藥材；3～5.供試品；6.陰性對照Fig 3 TLC of Salvia miltiorrhiza1.substance control；2.reference substance；3～5.test samples；6.negative control

圖4 沒藥的TLC1、2.對照藥材；3～5.供試品；6.陰性對照Fig 4 TLC of Myrrha1，2.reference substance；3～5.test samples；6.negative control

2.2.3 供試品溶液的制備[3，4]取本品內(nèi)容物約0.2 g，精密稱定，置50mL容量瓶中，加50%乙醇30mL，超聲處理30min，放至室溫，加50%乙醇至刻度，搖勻，離心，上清液用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取缺白芍的陰性樣品約0.2 g，精密稱定，置50mL容量瓶中，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.2.5 空白試驗 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10μL，按上述色譜條件進樣測定。結(jié)果，供試品溶液在與芍藥苷對照品溶液相應(yīng)保留時間處有相同的色譜峰出現(xiàn)，陰性對照溶液則無，表明在此色譜條件下，樣品中其他成分對芍藥苷的測定無干擾。色譜見圖5。

圖5 高效液相色譜圖A.芍藥苷對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.芍藥苷Fig 5 HPLC chromatogramsA.paeoniflorin control；B.test sample；C.negative control；1.paeoniflorin；

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取芍藥苷對照品溶液（115 μg·mL－1）1、3、5、8、10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定。以峰面積積分值（Y）為縱坐標，芍藥苷進樣量（X）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y＝1501.25518X+9.51630（r＝0.9999，n＝5）。結(jié)果表明，芍藥苷進樣量在0.115～1.150μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系，

2.2.7 精密度試驗 精密吸取芍藥苷對照品溶液10μL，重復(fù)進樣6次，按上述色譜條件測定。結(jié)果，RSD＝1.02%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液適量，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進樣，按上述色譜條件測定。結(jié)果，RSD＝0.58%（n＝7），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗 取同一批（批號:20100301）樣品適量，共6份，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測定。結(jié)果，芍藥苷的平均含量為7.240mg·g－1，RSD＝1.07%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 取已知含量的同一批樣品9份，每份約0.1 g，精密稱定，分別精密加入芍藥苷對照品溶液適量，照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.2.11 樣品含量測定 取3個批號的調(diào)肝止痛膠囊，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測定含量。結(jié)果，3批樣品（批號:20100301、20100302、20100303）中芍藥苷的含量分別為7.1508、7.0661、7.6973mg·g－1。

3 討論

白芍為方中主藥，對其進行定性、定量分析具有重要意義。本試驗采用TLC法對其進行定性鑒別，采用HPLC法對其有效成分芍藥苷進行含量測定，所建方法操作簡便、專屬性強、重復(fù)性好、陰性無干擾，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

中藥復(fù)方制劑以芍藥苷含量為測定指標的文獻報道很多，筆者參考有關(guān)文獻對多種流動相進行了考察。結(jié)果表明，以乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）作為流動相，芍藥苷峰形對稱，色譜峰之間分離較好。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

在含量測定中，分別對供試品溶液制備過程中的提取溶媒、提取方法和提取時間進行了考察[5，6]。提取溶媒考察中，分別采用甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇提取，結(jié)果采用50%甲醇、50%乙醇干擾少，峰形較好，而甲醇、乙醇干擾較大，從經(jīng)濟方面考慮，最終選用50%乙醇作為提取溶劑。提取方法考察中，分別采用靜置、超聲、回流、溫浸法提取樣品，結(jié)果以超聲、回流法提取效果較好，因超聲提取簡便，故采用超聲提取方法。提取時間考察中，分別考察了超聲處理15、30、45、60min對芍藥苷含量的影響，結(jié)果在30～60min內(nèi)含量變化不大，故選提取時間為30min。

綜合考慮《醫(yī)療機構(gòu)制劑注冊管理辦法》的要求和醫(yī)院制劑多批次小批量的特點，本試驗研究了白芍、丹參、枳殼、沒藥的TLC鑒別方法和芍藥苷的含量測定方法，所建立的標準可有效地控制該制劑的質(zhì)量。此外，對方中其余4味藥物的定性鑒別方法有待進一步研究。

[1]呂武清，龍新華.中成藥中的藥材薄層色譜鑒別[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，1997:151、192、315、378.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:96、附錄34.

[3]葉 娟，高文遠，劉新橋，等.白芍配方顆粒制備工藝優(yōu)化及質(zhì)量控制[J].中國藥房，2007，18（9）:661.

[4]唐 穎，朱玉曉，王淑云，等.HPLC法測定樂脈顆粒中丹參素、羥基紅花黃色素A和芍藥苷[J].中草藥，2008，39（4）:539.

[5]王榮紅，俞 嘉，熊志立，等.得生丸質(zhì)量標準研究[J].中國藥房，2010，21（15）:1387.

[6]許 勇，夏 晶，王 柯，等.胃應(yīng)丸的質(zhì)量標準研究[J].中成藥，2009，31（12）:1877.