抗乳腺小葉增生合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

王亞洲，呂建偉（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院，廣西 柳州 545005；.廣西柳州市中醫(yī)院，廣西 柳州 545001）

抗乳腺小葉增生合劑為廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，處方包括白芍、丹參、甘草、當(dāng)歸、柴胡、郁金、夏枯草、元胡、生牡蠣等數(shù)味中藥，具有散瘀止血、消腫止痛、活血調(diào)經(jīng)等功效[1]，臨床用于治療婦女乳腺小葉增生，療效明顯[2]，副作用小。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只對(duì)丹參進(jìn)行定性鑒別，規(guī)定相對(duì)密度≥1.02，并無(wú)含量測(cè)定內(nèi)容。為進(jìn)一步提高本制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更好地保證臨床療效，筆者參閱有關(guān)文獻(xiàn)[3，4]，對(duì)處方中的白芍、當(dāng)歸和丹參進(jìn)行了薄層色譜（TLC）鑒別，并用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定抗乳腺小葉增生合劑中芍藥苷、阿魏酸和甘草酸3種成分的含量。

1 儀器與試藥

LC-10ATvp HPLC儀（日本Shimadzu公司）；752紫外分光光度計(jì)（南京麒麟分析儀器有限公司）；AB-L電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；MP511電子pH計(jì)（上海三信儀表廠）；B2500S超聲波清洗器（美國(guó)Branson公司）。

甘草、柴胡、元胡、生牡蠣藥材（柳州市百草堂中藥飲片廠，批號(hào)分別為110817、110922、110812、110825）；郁金藥材（國(guó)藥控股柳州有限公司，批號(hào):20110914）；夏枯草藥材（柳州市神農(nóng)飲片廠，批號(hào):20110811）；芍藥苷、丹參酮ⅡA對(duì)照品和白芍、當(dāng)歸、丹參對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110736-200630、110766-200518、 120905-201109、 120927-201014、 120923-200912）；阿魏酸、甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)分別為20110406、YY20101107，含量均≥98%）；抗乳腺小葉增生合劑（廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院制劑室自制，批號(hào):110715、110728、110810）；甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 定性鑒別

2.1 白芍的TLC鑒別

取本品10mL，加70%甲醇10mL，超聲（功率:120 W，頻率:40 kHz）處理30min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右掖?mL使溶解，作為供試品溶液；稱取白芍對(duì)照藥材粉末0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液；按處方組成，取除白芍以外的其余藥材，按工藝要求制成缺白芍陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液；另取芍藥苷對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照TLC法[1]試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材、對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。白芍的TLC見(jiàn)圖1。

2.2 當(dāng)歸的TLC鑒別

取本品10mL，用乙醚振搖提取3次，每次10mL，合并乙醚提取液，揮干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇1mL使溶解，作為供試品溶液；稱取當(dāng)歸對(duì)照藥材粉末0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液；按處方組成，取除當(dāng)歸以外的其余藥材，按工藝要求制成缺當(dāng)歸陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液；另取阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。照TLC法[1]試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材、對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。當(dāng)歸的TLC見(jiàn)圖2。

圖1 白芍的TLC1～3.供試品；4.芍藥苷對(duì)照品；5.對(duì)照藥材；6.陰性對(duì)照Fig 1 TLC of Paeonia lactiflora1～3.test samples；4.paeoniflorin control；5.reference substance；6.negative control

圖2 當(dāng)歸的TLC1～3.供試品；4.阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品；5.對(duì)照藥材；6.陰性對(duì)照Fig 2 TLC of Angelica sinensis1～3.test samples；4.ferulic acid standard；5.reference substance；6.negative control

2.3 丹參的TLC鑒別

取本品10mL，加乙醚10mL，振搖，放置1 h后取乙醚液，重復(fù)3次上述操作，合并乙醚液，濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴?mL使溶解，作為供試品溶液；稱取丹參對(duì)照藥材粉末0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液；按處方組成，取除丹參以外的其余藥材，按工藝要求制成缺丹參陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液；另取丹參酮ⅡA對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照TLC法[1]試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯（19∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材、對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。丹參的TLC見(jiàn)圖3。

圖3 丹參的TLC1～3.供試品；4.丹參酮ⅡA對(duì)照品；5.對(duì)照藥材；6.陰性對(duì)照Fig 3 TLC of Salvia miltiorrhiza1～3.test samples；4.tanshinoneⅡAcontrol；5.reference substance；6.negative control

3 含量測(cè)定

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Inertsil C8（250mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相:乙腈-0.1%磷酸-四氫呋喃（18∶80∶2）；檢測(cè)波長(zhǎng):300 nm；柱溫:30℃；流速:1.0mL·min－1；進(jìn)樣量:20μL。在此色譜條件下，芍藥苷、阿魏酸和甘草酸的色譜峰均能達(dá)到基線分離，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。芍藥苷保留時(shí)間約為10.1min，阿魏酸保留時(shí)間約為13.5min，甘草酸保留時(shí)間約為21.6min。色譜見(jiàn)圖4。

3.2 混合對(duì)照品溶液的制備

圖4 高效液相色譜圖A.供試品；B.陰性對(duì)照；C.混合對(duì)照品；1.芍藥苷；2.阿魏酸；3.甘草酸Fig 4 HPLC chromatogramsA.test sample；B.negative control；C.mixed control；1.paeoniflorin；2.ferulic acid；3.glycyrrhizic acid

稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒重的芍藥苷對(duì)照品和阿魏酸、甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品各適量，精密稱定，置于同一棕色容量瓶中，加50%甲醇制成每1mL分別含芍藥苷1038.6μg、阿魏酸86.2μg和甘草酸1265.2μg的混合對(duì)照品溶液。

3.3 供試品溶液的制備

精密量取抗乳腺小葉增生合劑10mL，置于100mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

3.4 陰性對(duì)照溶液的制備

按照處方組成，取除白芍、當(dāng)歸和甘草以外的其余藥材，按工藝要求制成不含芍藥苷、阿魏酸和甘草酸的陰性合劑，照“3.3”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

3.5 線性關(guān)系考察

取上述混合對(duì)照品溶液適量，用50%甲醇稀釋成6個(gè)濃度，即得芍藥苷濃度分別為 25.96、51.93、103.86、155.79、207.72、259.65μg·mL－1，阿魏酸濃度分別為2.15、4.31、8.62、12.93、17.24、21.55μg·mL－1，甘草酸濃度分別為31.63、63.26、126.52、189.78、253.04、316.3μg·mL－1的溶液，依次進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定。再分別以各組分的檢測(cè)濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得芍藥苷、阿魏酸和甘草酸的回歸方程分別為Y＝6037X+769（r＝0.9995，n＝6）、Y＝171526X－11067（r＝0.9998，n＝6）、Y＝23752X+2136（r＝0.9996，n＝6）。結(jié)果表明，芍藥苷、阿魏酸和甘草酸的檢測(cè)濃度分別在25.96～259.65、2.15～21.55、31.63～316.30μg·mL－1范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

3.6 精密度試驗(yàn)

分別取上述混合對(duì)照品溶液1000、500、200μL，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容，制備成高、中、低濃度的溶液。分別在同日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；在5 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算日間精密度。結(jié)果，芍藥苷、阿魏酸和甘草酸日內(nèi)精密度的RSD分別為1.74%、1.05%和1.58%（n均為5）；日間精密度的RSD分別為2.76%、2.27%和2.62%（n均為5），表明儀器精密度良好。

3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批（批號(hào):110715）抗乳腺小葉增生合劑適量，按“3.3”項(xiàng)下方法平行制成6份供試品溶液，照上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果，芍藥苷、阿魏酸和甘草酸的RSD分別為0.92%、1.15%和1.34%（n均為6），表明本方法重復(fù)性良好。

3.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批（批號(hào):110715）抗乳腺小葉增生合劑適量，共6份，分別置于容量瓶中，再加入一定量的混合對(duì)照品溶液，按“3.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，照上述色譜條件測(cè)定，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

3.9 樣品含量測(cè)定

取3批抗乳腺小葉增生合劑各適量，分別按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算各組分含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝5）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝5）

4 討論

本品共含有10味中藥，試驗(yàn)選擇其中3味進(jìn)行了TLC鑒別，其余藥味由于在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)干擾大、重復(fù)性較差等因素，故暫不納入標(biāo)準(zhǔn)。

采用HPLC法同時(shí)測(cè)定制劑中幾種組分的含量時(shí)，選擇合適的檢測(cè)波長(zhǎng)尤為關(guān)鍵。筆者對(duì)芍藥苷、阿魏酸和甘草酸的對(duì)照品溶液分別進(jìn)行全波長(zhǎng)紫外掃描，確定芍藥苷最大吸收波長(zhǎng)為230 nm，阿魏酸最大吸收波長(zhǎng)為316 nm，甘草酸最大吸收波長(zhǎng)為250 nm。在上述色譜條件下，分別于230、250、300、316、350 nm等波長(zhǎng)處對(duì)供試品溶液進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)阿魏酸最大吸收波長(zhǎng)316 nm附近的300 nm處所得的HPLC圖譜上各組分峰分離效果較好，雜質(zhì)干擾峰亦被消除，且能較好地兼顧含量較小的阿魏酸的峰形，因此選擇300 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

參考有關(guān)文獻(xiàn)[5，6]，經(jīng)過(guò)對(duì)不同流動(dòng)相的摸索，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸-四氫呋喃（18∶80∶2）為流動(dòng)相時(shí)，3組分的出峰時(shí)間更合適，峰形好、無(wú)拖尾，且不受雜質(zhì)峰干擾。在流動(dòng)相中加入少量的四氫呋喃，很好的改善了峰形。但四氫呋喃容易與流動(dòng)相中的溶解氧形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會(huì)提高背景吸收（特別是在260 nm波長(zhǎng)以下），導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度的輕微降低[7]，所以試驗(yàn)流動(dòng)相必須預(yù)先徹底脫氣。四氫呋喃易被氧化從而可能在色譜圖中產(chǎn)生倒峰，故添加四氫呋喃的流動(dòng)相宜現(xiàn)用現(xiàn)配。

本品中白芍、當(dāng)歸、甘草等均為主要藥味，方法學(xué)研究結(jié)果證明，采用TLC法對(duì)上述3味藥材進(jìn)行定性鑒別，色譜斑點(diǎn)清晰、專屬性強(qiáng)。本試驗(yàn)建立的以HPLC法同時(shí)測(cè)定芍藥苷、阿魏酸和甘草酸含量的方法靈敏度高、專屬性好，為其他制劑同時(shí)測(cè)定上述3種組分提供了方法參考。相比于文獻(xiàn)[8]中的調(diào)pH值后再用乙醚萃取的方法，本試驗(yàn)中僅需對(duì)合劑稀釋即可進(jìn)行含量測(cè)定，操作簡(jiǎn)便易行。對(duì)3批樣品分別進(jìn)行分析，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，說(shuō)明筆者建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可用于抗乳腺小葉增生合劑的質(zhì)量控制。

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