GuttaFlow根管充填材料對人牙周膜成纖維細(xì)胞的毒性

馬忠雄，雷麗珊，王燕煌，鐘 聲

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，福建 福州 350002)

根管治療術(shù)的目的是嚴(yán)密封閉根管系統(tǒng)，并獲得損傷根尖周組織的生物性愈合，因此充填方法和充填材料的選擇至關(guān)重要。GuttaFlow系統(tǒng)是一種新型的常溫流動牙膠根管充填系統(tǒng)，所含納米級顆粒使其具有良好的流動性和加壓觸變性，并使根管充填簡捷、高效。但良好的流動性勢必增加超填風(fēng)險，超填材料與根尖周組織直接接觸，因此材料的生物相容性將直接影響根管治療術(shù)的最終效果［1-2］。本研究采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法測定GuttaFlow系統(tǒng)和臨床常用的兩種根管封閉劑的浸提液對人牙周膜成纖維細(xì)胞(periodontal ligament fibroblasts，PDLFs)增殖情況的影響，評估該系統(tǒng)的細(xì)胞毒性，以期對其生物安全性進(jìn)行評價。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

GuttaFlow常溫流動牙膠根管充填材料 (Cohene/Whaledent公司，瑞士)，AH-Plus根管封閉劑(Densply公司，德國)，Endomethasone根管封閉劑(Septodont公司，法國)，DMEM 培養(yǎng)液(Gibco公司，美國)，胎牛血清(Hyclone公司，美國)，CO2培養(yǎng)箱(Heraeus公司，德國)，倒置相差顯微鏡(廣州光學(xué)儀器廠)，生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司)，酶標(biāo)儀(Human公司，德國)，MTT(Sigma公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 人牙周膜成纖維細(xì)胞(PDLFs)體外培養(yǎng)

選擇因正畸需要而完整拔除的健康恒牙，拔出后立即置于含抗生素(青霉素100 U/mL，鏈霉素100 g/mL)的DMEM培養(yǎng)液，超凈工作臺內(nèi)刮取根中1/3牙周膜，采用組織塊法，在飽和濕度、50 mL/L CO2、950 mL/L空氣、37℃標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育。倒置顯微鏡下嚴(yán)密觀察細(xì)胞生長狀況，待細(xì)胞從組織塊周圍游出并鋪滿培養(yǎng)板底70%后，胰酶消化，傳代，取第4代細(xì)胞用于實(shí)驗。

1.2.2 材料浸提液的制備

取GuttaFlow常溫流動牙膠、AH-plus根管封閉劑、Endomethasone根管封閉劑3種實(shí)驗料，分別按操作說明書調(diào)制后，充填于直徑5 mm、厚3 mm圓柱狀孔模具中，待其充分固化(72 h)后形成統(tǒng)一規(guī)格的材料塊。然后，分別將各材料塊浸入含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中(材料塊的表面積/培養(yǎng)液體積=0.6 cm2/mL)，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下浸泡72 h，取各材料浸提液原液濾膜過濾除菌備用。

1.2.3 分組和細(xì)胞毒性實(shí)驗

取對數(shù)生長期第4代HPDLFs以3×103密度接種于96孔板，于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下同步化培養(yǎng)24 h后吸棄原培養(yǎng)液，根據(jù)不同充填材料將細(xì)胞隨機(jī)分為3大組，每一大組再隨機(jī)分為6個亞組(4個實(shí)驗組、1個標(biāo)準(zhǔn)對照組和1個空白對照組)。4個實(shí)驗組分別加入含相應(yīng)材料浸提液終末濃度分別為100%、50%、25%和12.5%的 DMEM;標(biāo)準(zhǔn)對照組加入不含材料浸提液的DMEM;空白對照組加入不含細(xì)胞的DMEM，置于CO2培養(yǎng)箱中標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后1、3、5、7 d取出各組細(xì)胞(每組復(fù)5孔)，每孔加入MTT 20 μL孵育4 h，棄孔內(nèi)液體，加入二甲基亞楓液150 μL孵育10 min，微振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解后，在酶標(biāo)儀上于492 nm波長下測每孔OD值。按公式計算各組細(xì)胞相對增殖率(Relative Growth Rate，RGR)。

1.2.4 毒性評級［3］

采用5級制進(jìn)行材料細(xì)胞毒性分級(Cytoxicity Scale，CTS)(表1)。

表1 材料細(xì)胞毒性分級評價標(biāo)準(zhǔn)

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 正常牙周膜成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)約3～7 d細(xì)胞從組織塊周圍游出，放射狀生長(圖1a)。細(xì)胞為典型成纖維樣細(xì)胞，呈長梭形，胞漿突2～4個，胞體豐滿，胞漿均勻，胞核圓形，核仁清晰。約20 d左右PDLFs鋪滿瓶底70% ～80%，細(xì)胞生長旺盛，呈漩渦狀、柵欄狀排列(圖1b)。

圖1 原代培養(yǎng)的人PDLFs(×100)

2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗

2.2.1 各組細(xì)胞增殖情況及毒性評級

細(xì)胞在100%濃度的浸提液中培養(yǎng)時，對照組、AH-Plus和GuttaFlow組的OD值均隨時間延長而不斷升高，3組各時間點(diǎn)均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)(圖2a);而Endomethasone的OD值自第3天開始呈持續(xù)下降趨勢，與其他3組相比，各時間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。細(xì)胞在50%、25%和12.5%濃度的浸提液中培養(yǎng)時，5 d前各組OD值均呈不斷上升趨勢，且各組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);此后，對照組、AH-Plus和 GuttaFlow 組OD值仍不斷升高，且3組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，而Endomethasone則出現(xiàn)顯著下降，與其他3組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖2b～d)。

AH-Plus組和GuttaFlow組在各濃度組各時點(diǎn)的RGR分別為77.1% ～141%和79.8% ～115.9%，毒性評級均為0～Ⅰ級，評價結(jié)果為無細(xì)胞毒性，且細(xì)胞毒性未隨時間延長而增強(qiáng)。Endomethasone組在100%濃度浸提液中培養(yǎng)時，第1天RGR為109.2%，毒性評級為0級，評價結(jié)果為無細(xì)胞毒性;而后隨時間延長RGR降至13.6%，毒性評級隨之增至Ⅲ～Ⅳ級，評價結(jié)果為中度細(xì)胞毒性;在50%濃度時，第1天RGR為104.3%，毒性評級為0級，評價結(jié)果為無細(xì)胞毒性;而后隨時間延長RGR降至43.5%，毒性評級增至Ⅲ級，評價結(jié)果為中度細(xì)胞毒性;在低濃度(25%和12.5%)時的RGR為60.7% ～112.0%，毒性評級隨時間由0級增至Ⅱ級，評價結(jié)果無細(xì)胞毒性至輕度細(xì)胞毒性(表2)。

2.2.2 各組細(xì)胞形態(tài)變化

倒置顯微鏡下觀察，GuttaFlow和AH-Plus組細(xì)胞形態(tài)未見明顯異常;Endomethasone組，當(dāng)OD值明顯降低時，細(xì)胞顯示出不同的形態(tài)學(xué)變化。以100%濃度組為例(圖3)。

圖2 三種材料在不同濃度時的增殖曲線

表2 各時間點(diǎn)3種材料不同濃度的毒性評級 (%)

圖3 100%濃度時各組細(xì)胞形態(tài)(×100)

3 討論

在齒科材料的細(xì)胞毒性實(shí)驗中，細(xì)胞對材料的敏感性直接決定了實(shí)驗結(jié)果，越敏感的細(xì)胞越能反映材料毒性。目前細(xì)胞毒性實(shí)驗可選用已建株的細(xì)胞系或原代培養(yǎng)細(xì)胞，原代培養(yǎng)細(xì)胞多為正常二倍體細(xì)胞，它與轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞系存在差異，主要表現(xiàn)為有絲分裂速度、密度依賴性生長調(diào)節(jié)、衰老速度、培養(yǎng)基選擇、線粒體功能、可接受的生長物質(zhì)及熱敏感性等方面。由于這些不同，原代培養(yǎng)的正常二倍體細(xì)胞對毒性物質(zhì)的敏感性與轉(zhuǎn)化細(xì)胞系存在差異［4］，將其用作材料毒性的靶細(xì)胞時更接近臨床實(shí)際，結(jié)果也更能反映材料的臨床使用效果。

興起于21世紀(jì)初的充填整體化(monoblock)代表著根管治療術(shù)發(fā)展的新趨勢，其強(qiáng)調(diào)改進(jìn)根管充填的封閉能力，增強(qiáng)牙根抗力的理念已經(jīng)引起廣泛關(guān)注［5］。充填整體化指根管充填材料就位固化后與根管形成封閉性能良好、機(jī)械性能均一的整體結(jié)構(gòu)。目前常用的冷牙膠側(cè)壓充填術(shù)和熱牙膠充填術(shù)均存在一定缺陷，冷牙膠只能發(fā)生少量的壓縮變形，與根管壁的適合性差，不具流動性，需側(cè)向加壓;熱牙膠易致高溫?fù)p傷，冷卻收縮易引起微滲漏，需垂直加壓等。GuttaFlow常溫流動牙膠根管充填系統(tǒng)將含聚二甲基硅氧烷基質(zhì)的封閉劑與直徑＜30 μm的牙膠顆粒在體外合二為一，形成在常溫下具有流動性的充填材料。當(dāng)輸入根管后通常只需插入一根牙膠尖充填，因此又被稱為單核充填技術(shù)(single cone obtruation technique)［6］。由于其成分與牙膠尖類似，固化后可與牙膠尖成為一個整體;而聚二甲基硅氧烷特有的觸變(thixotropy)特性使其在壓力作用下粘性下降，流動性增強(qiáng)，易于進(jìn)入根管系統(tǒng)的各分支;此外其固化不受溫度和濕度的影響，固化后體積不收縮反而有輕微膨脹(0.2%)，均有利于達(dá)到嚴(yán)密封閉的效果［7-8］;同時較少使用側(cè)壓，不會對牙根的抗力產(chǎn)生影響［9］;又因該系統(tǒng)操作簡便、耗時短、技術(shù)敏感性低，因此適應(yīng)了充填整體化的理念，應(yīng)用前景廣闊。但良好的流動性也增加了超填風(fēng)險，超填材料與根尖周組織直接接觸，因此有必要對其生物相容性進(jìn)行全面、充分的評價。

本實(shí)驗選用臨床上常用的根管封閉劑AHPlus和Endomethasone與Gutta Flow進(jìn)行細(xì)胞毒性比較。AH-Plus為環(huán)氧樹脂類根管封閉劑，其前身為AH26，目前在冷側(cè)壓和熱牙膠充填中均得到廣泛應(yīng)用。雖然有研究表明［10-11］新鮮調(diào)制的AHPlus顯示出對培養(yǎng)細(xì)胞的毒性，并指出這可能是由于封閉劑中的少量甲醛、胺和環(huán)氧樹脂成分的釋放所致，但隨時間的延長和可濾取成分的減少，這種影響在24 h后基本消退［12］，因此通常認(rèn)為完全固化后的 AH-Plus細(xì)胞毒性較小。本結(jié)果顯示，AH-Plus浸提液對細(xì)胞增殖并無明顯影響，各濃度組的毒性評級均為0～Ⅰ級，評價結(jié)果為無細(xì)胞毒性。Endomethasone為氧化鋅丁香油類根管封閉劑，其術(shù)后病人疼痛反應(yīng)較小，常用于冷側(cè)壓充填中，目前認(rèn)為其對細(xì)胞的刺激性較大。本結(jié)果亦顯示，較高濃度的Endomethasone浸提液對細(xì)胞增殖有抑制作用，具一定的細(xì)胞毒性。

本實(shí)驗中細(xì)胞在高濃度GuttaFlow浸提液中的增殖較低濃度組稍差，但差異并無統(tǒng)計學(xué)意義。這可能與GuttaFlow中所含納米銀及其濃度有關(guān)［13］。納米銀是GuttaFlow系統(tǒng)中的無機(jī)抗菌成分，可在根管內(nèi)持續(xù)發(fā)揮防腐、殺菌作用。Sj?gren等的研究［14］顯示，以納米銀為基礎(chǔ)的無機(jī)抗菌成分會對鼠成纖維細(xì)胞L929產(chǎn)生細(xì)胞毒性，且隨濃度不同細(xì)胞毒性也會發(fā)生變化。本結(jié)果顯示，較高濃度GuttaFlow雖對細(xì)胞增殖具有一定副作用，但這種作用很小，尚不足以對細(xì)胞的增殖產(chǎn)生明顯影響，因此細(xì)胞在各濃度GuttaFlow浸提液中的增殖均與對照組無明顯差異。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)的觀察，認(rèn)為完全固化的GuttaFlow對人牙周膜成纖維細(xì)胞無細(xì)胞毒性，與AH-Plus相當(dāng)。

在本研究中，較高濃度的Endomethasone浸提液對細(xì)胞增殖顯示出抑制作用，且隨著時間延長，抑制作用愈加顯著，甚至可致大多數(shù)細(xì)胞死亡。這可能與其中含有鹽酸氫化可的松和丁香油酚有關(guān)。鹽酸氫化可的松雖具有抗炎等作用［9］，但其對成纖維細(xì)胞增殖具有抑制作用，且成明顯的劑量依賴性［15］;丁香酚的存在有助于增強(qiáng)封閉劑對糞腸球菌等的抗菌作用［16］，但丁香酚與細(xì)胞黏附力增強(qiáng)的另一結(jié)果，就是會進(jìn)一步影響細(xì)胞增殖。因此在高濃度組Endomethasone的毒性評級可達(dá)Ⅲ～Ⅳ級。但由于口內(nèi)實(shí)際情況和體外實(shí)驗存在差異，因此體外實(shí)驗一般以25%濃度為標(biāo)準(zhǔn)來評價材料的毒性情況。本實(shí)驗中25%濃度組Endomethasone毒性評級為Ⅰ～Ⅱ級，僅有輕度細(xì)胞毒性。

雖然本結(jié)果顯示，GuttaFlow作為一種新型的常溫流動牙膠根管充填系統(tǒng)，對人牙周膜成纖維細(xì)胞無細(xì)胞毒性，與臨床常用的根管封閉劑AH-Plus相當(dāng)，但體外細(xì)胞毒性實(shí)驗只是檢測材料生物相容性的一個方面，對該材料的全面評價還有賴于進(jìn)一步長期綜合評價。

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