激光共聚焦顯微鏡觀察不同光照模式對復合樹脂充填體微滲漏的影響

趙夢明，馬會強，劉大勇，賈 智

(天津醫科大學口腔醫院牙體牙髓科，天津 300070)

齲病是在多種因素作用下，牙體硬組織發生的一種慢性進行性破壞的感染性疾病，是目前發病率最高的口腔疾病之一。牙體硬組織的新陳代謝很弱，釉質內沒有任何基于細胞活動的修復功能，一旦遭到破壞，必須用人工材料進行修復。目前臨床上在進行充填治療時主要選用光固化復合樹脂。盡管樹脂材料在不斷改進，材料的硬度、色澤等都已經取得了很大的進步，但是由于固化收縮引起的微滲漏一直沒有得到很好的改善［1－2］，進而引起修復體破壞、牙釉質微裂、微滲漏、繼發齲、術后敏感等并發癥［3－5］。影響微滲漏的因素有很多［6－8］，主要有樹脂種類、粘結劑類型以及光固化方式、時間、角度等。復合樹脂的固化模式有:弱光引導、間歇光照和高強度光照等3種。弱光引導法是先用低強度光引發聚合反應，再用高強度光照射固化;間歇光照技術采用恒定光強，短暫光照之后短暫停歇，循環數次完成固化。本實驗擬采用激光共聚焦顯微鏡觀察比較上述3種不同固化模式下，固化后的復合樹脂與牙體組織之間形成的微滲漏差別。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

Adper single Bond 2全酸蝕系統、FiltekTMZ350復合樹脂(3M公司，美國);LED光固化燈(belmont治療椅自帶，日本);Isomet低速切片機(Bueh ler，美國);激光掃描共聚焦顯微鏡(LEICA TCS SP5型，德國);羅丹明B(Rhodamine－B，Sigma公司，美國)。

1.2 方法

自天津醫科大學口腔醫院外科門診拔除的離體牙中選取牙體完整，無齲損、無裂紋的恒牙30個，刮除牙面軟組織及結石后，用高速渦輪機在每個牙的頰面正中制備箱狀洞型(頰舌徑、近遠中徑均為4 mm，洞深為2 mm)，要求底平，壁直，點線角圓鈍。窩洞制備完成后的所有標本沖洗干燥后隨機分為A、B、C 3組:A組弱光引導固化;B組間歇光照固化;C高強度光照固化。分別用Z350復合樹脂分層充填，固化，常規拋光。然后用光固化樹脂封閉根尖孔，并在距離充填體邊緣1mm之外的所有牙面均勻涂布兩層指甲油，待其完全干燥后，置于1 g/L羅丹明B熒光染液中37℃水溶條件下浸泡。24 h后取出所有標本蒸餾水沖洗10 s，分別用帶有金剛砂片的Isom et低速切片機通過充填體中央將牙齒自頰舌方向沿長軸剖開。檢測面用粗、細砂紙依次打磨平整后，分別在100% 相對濕度下用激光共聚焦檢測，氬激光掃描(點面掃描2×4，激發波長546 nm，發射波長600 nm)。同時使用LEICA TCS SP5分析軟件對圖像進行測量并按以下微滲漏分級標準［9］記分:0=無染料滲入;1=染料沿著洞壁滲入，深度＜1/3壁;2=染料沿著洞壁滲入，深度＜2/3壁;3=染料沿著洞壁滲入，深度2/3壁至平齊洞底，但未累及髓壁;4=染料滲入累及髓壁。

1.3 統計方法

采用SPSS 12.0統計軟件進行統計分析，計數資料采用秩和檢驗，計量資料()用單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

肉眼觀3組標本均可見羅丹明染料浸入(圖1)。激光共聚焦顯微鏡(CLSM)下可見牙體充填標本的微滲漏呈現清晰的熒光染色圖像，3組標本均有染料滲入(圖2)。

無論在微滲漏分級還是深度方面，A、B、C 3組間相比均無統計學差異(P＞0.05)(表1～2)。

圖1 肉眼觀3組染料浸入深度

圖2 激光共聚焦顯微鏡下染料浸入深度(Ⅰ為牙體組織，Ⅱ為復合樹脂)

表1 3組標本微滲漏級別比較 (個)

表2 3組標本微滲漏深度比較(μm，)

表2 3組標本微滲漏深度比較(μm，)

3組相比 P＞0.05

組別 微滲漏深度A 1 948.20 ±48.62 B 1 941.90 ±65.80 1 951.60 ±65.48 C

3 討論

光固化復合樹脂材料具有美觀性、高粘結性、良好的生物安全性以及與牙體組織有相似的強度等優點，是時下最常用的牙體修復材料。但樹脂修復后因樹脂材料與牙體組織之間的微滲漏一直沒有得到完美解決［1－2］。微滲漏會使窩洞壁與復合樹脂之間產生細菌、液體的通道，從而引起術后敏感、充填體著色、繼發齲，進一步發展會引起充填體破壞脫落，導致牙髓組織感染，引起牙髓炎、根尖周炎等［3－5］。因此，樹脂修復時如何減少甚至消除微滲漏一直是口腔臨床醫生和材料學家關注的熱點。

影響樹脂修復體微滲漏的因素有很多種，包括樹脂的材料性能、醫師技術水平、充填方式、窩洞壁表面玷污層的存在、洞型與洞斜面的制備、粘結劑的選擇、牙面酸蝕的程度、光固化燈的種類、光固化的方式、光固化時間及長期咀嚼壓力致充填體形變等［6－8］。本實驗重點關注光照方式對光固化復合樹脂聚合收縮后產生微滲漏的影響。關于不同光照方式對微滲漏的影響一直以來存在兩種不同的看法，一方提出弱光引導和間歇光照可提高光固化復合樹脂的邊緣密閉性，而另有學者則認為弱光引導和間歇光照對光固化復合樹脂固化后的邊緣密閉性無明顯影響。有鑒于此，本實驗通過激光共聚焦顯微鏡觀察比較3種光固化方式對樹脂修復體邊緣微滲漏的影響，以期為臨床提供參考。

微滲漏的檢測方法有很多種［10－13］，其中染料滲漏研究是牙體微滲漏檢測中的重要方法之一［14－15］，根據染料擴散的方式分為順向法和逆向法。本實驗中采用順向法，即將離體受試牙浸入特定濃度的染液中，一定時間后取出，激光掃描共聚焦顯微鏡并測量染料沿窩洞壁滲透的深度［16］，以評價充填材料與牙體組織的密合性。

激光掃描共聚焦顯微鏡，是上世紀中期發展起來并得到廣泛應用的高新技術，它突破了光學顯微鏡不能對細胞或組織內部進行定位檢測的限制，彌補了電鏡在宏觀和動態實時研究等方面的不足，且又克服了其在操作和制樣等方面的缺點。激光掃描共聚焦顯微鏡分析法是利用激光共聚焦顯微成像原理發展而成的新技術，具有靈敏度高及可觀察空間結構的特點，可應用于細胞標記及非破壞性、非侵襲性的組織器官活體檢測等。

激光掃描共聚焦顯微鏡相對光學顯微鏡的優點主要體現以下幾個方面［14－16］:① CLSM 的圖像是以電信號的形式記錄下來的，所以可采用各種模擬的和數字的電子技術進行圖像處理;②CLSM利用共聚焦系統有效地排除了焦點以外的光信號干擾，提高了分辨率，顯著改善了視野的廣度和深度，使無損傷的光學切片成為可能，達到了最佳三維空間定位;③由于CLSM能隨時采集和記錄檢測信號，為生命科學開拓了一條觀察活細胞結構及特定分子、離子生物學變化的新途徑;④除具有成像功能外，CLSM還具有圖像處理功能和細胞生物學功能，前者包括光學切片、三維圖像重建、細胞物理和生物學測定、熒光定量、定位分析以及Ca2+、pH及其他活細胞內離子的實時定量測定;后者包括粘附細胞的分選、激光細胞顯微外科及光陷阱技術、熒光漂白后恢復(FRAP)技術，細胞間通訊的研究，細胞膜流動性測定以及光活化技術。

本結果顯示，3種光固化模式對復合樹脂固化后的微滲漏無明顯影響，與有些實驗報道認為弱光引導和間歇光照可改善樹脂的邊緣密閉性的結果不同，其原因可能是采用了不同的光固化復合樹脂材料，因為微滲漏主要是樹脂光固化時由聚合收縮應力、粘結力、樹脂流動能力在聚合過程中相互作用而致，材料本身的性能是引起聚合收縮、影響邊緣密閉性進而引起微滲漏的至關重要的因素，如果采用聚合收縮大、性能較差的復合樹脂材料，固化時不同光照方式可能會產生較大的影響。

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