血小板裂解液對人根尖牙乳頭干細胞和牙周膜干細胞體內外增殖、礦化能力的影響

白 玉，陳 博，，王捍國，穆云靜，孔 輝，劉向輝，余 擎

(1.第四軍醫大學口腔醫學院，陜西 西安 710032;2.解放軍八一醫院口腔科，江蘇 南京 210001;3.解放軍309醫院旃壇寺門診部，北京 100034)

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有自我更新、多向分化能力的干細胞，其作為組織工程和組織再生領域極具應用前景的種子細胞來源，受到了越來越廣泛的關注。在口腔醫學領域，諸如骨髓間充質干細胞(BMMSCs)、脂肪干細胞(ADSCs)、臍血干細胞(UCBSCs)以及牙源性干細胞［1］等多種間充質干細胞已經被有效分離、培養，并應用于牙齒組織工程相關研究，其中牙源性干細胞最具優勢。牙源性干細胞主要包括牙髓干細胞(DPSCs)、脫落乳牙干細胞(SHED)、牙周膜干細胞(PDLSCs)［2］和近期分離自未發育完成恒牙根尖乳頭的根尖牙乳頭干細胞(Stem cells from the apical papilla，SCAP)［3］。研究發現 SCAP是牙根部成牙本質細胞和根部牙髓細胞的重要來源，對根部牙本質形成和發育起關鍵作用［4］，而PDLSCs則已被證明對牙根骨質、牙周膜和牙槽骨等牙周組織的生長發育起重要作用，這兩種細胞植入免疫缺陷鼠體內可分別形成牙本質牙髓樣復合體和牙骨質 -牙周膜樣結構［2-3］，預示著其在牙根、牙周組織工程和組織再生領域的應用前景。干細胞的遷移、增殖、分化等過程需要多種生長因子參與調控，此前已有諸多使用血小板裂解液(platelet lysate，PL)培養間充質干細胞 MSCs的報道［5-8］，近期的研究更證實富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)［9］或 PL［10］能夠促進 DPSCs 或PDLSCs等牙源性干細胞的增殖和分化。本研究分離培養同一組個體來源的SCAP和PDLSCs，通過比較一定濃度的PL對在不同生長模式下干細胞增殖、礦化能力等生物學的影響，以期找到PL應用于牙根組織工程種子細胞的適宜方式，為日后的基礎研究和臨床應用提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

改良型α-MEM培養基和胎牛血清(FBS，HYCLONE，美國);胰蛋白酶(Gbico，美國);HA-TCP(四川大學生物工程材料研究中心);抗壞血酸、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、Alizarin Red S、Oil Red O(Sigma，美國);肝素鈉 (Roche，瑞士);SABC試劑盒(北京中杉金橋);鼠抗人Vimentin(武漢博士德);CD24多克隆抗體、FITC二抗(R＆D，美國);鼠抗人 STRO-1-APC、CD29-PE、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-PE、CD90-PE、CD105-FITC、CD146-PE(BIOLEGEND，美國);自動CO2培養箱(HERA cell，德國);倒置顯微鏡(LEICA，德國);流式細胞儀(BD，美國);掃描電鏡(HITACHI S3400N，日本)。

1.2 SCAP和PDLSCs兩種干細胞的分離、培養、純化和鑒定

收集15～20歲志愿者(知情同意)因正畸需要而完整拔除的未發育完全的新鮮健康第三磨牙，用含雙抗的無血清α-MEM培養基反復沖洗后，無菌條件下先后分離根尖牙乳頭，刮取根中1/3部位的牙周膜組織，采用組織塊法分離獲得原代細胞，以含200 mL/L胎牛血清、50 μg/mL抗壞血酸、2 mmol/L谷胺酰胺、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素的α-MEM培養基培養于37℃、50 mL/L CO2孵箱中。每2～3 d更換1次培養液，待細胞生長匯合后以胰蛋白酶(2 g/L胰蛋白酶加0.2 g/L EDTA)消化收集細胞，按1∶3傳代。取對數生長期的P1代細胞以有限稀釋法獲得單細胞克隆，待克隆長至96孔板孔底80%后，取多個克隆培養的細胞胰酶消化混合，擴大培養。收集P3代相同個體來源的SCAP和PDLSCs，經免疫細胞化學染色和流式細胞儀檢測 Vimentin、STRO-1、CD24、CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105、CD146 等特定抗原的表達;同時對細胞成脂、礦化誘導后，分別行Oil Red O染色及Alizarin Red S染色，鑒定細胞多向分化能力。

1.3 血小板裂解液的制備

第四軍醫大學西京醫院輸血科選取新鮮采集的ACD-A抗凝血小板10人份，參考并改進文獻［10-11］的方法，將血小板混勻后以生理鹽水重懸，去除血漿等雜質，使血小板濃度達1×109/mL;將所獲樣本經-80℃與37℃反復凍融3次(每次間隔12 h)，使血小板內生長因子充分釋放。凍融裂解產物900 g離心30 min取上清即為血小板裂解液，用0.22 μm濾器過濾后分裝于無菌EP管內，-80℃凍存備用，使用前37℃水浴融解，以不同體積比加入培養基中。

1.4 PL對SCAP和PDLSCs在體內、外增殖和礦化能力的影響

1.4.1 細胞培養體系

以礦化誘導液(含100 mL/L胎牛血清、50 μg/mL抗壞血酸，10-6mol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油鈉、2 mmol/L谷胺酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的α-MEM培養基)為基礎培養基，按表1以相應體積比加入1.3中所得的PL制成條件培養基，并在培養基中加入2 IU/mL的肝素以防止PL中的凝血因子與培養基中的組分反應生成凝膠［11］(表1)。

1.4.2 PL對SCAP和PDLSCs在體外三維培養模式下增殖的影響

取直徑5 mm，厚1.5 mm，孔徑50 ～300 μm，孔隙率為52%的HA-TCP支架材料，經高溫高壓滅菌后浸泡于FBS內置4℃冰箱過夜，取出后于超凈臺內室溫干燥備用。參考文獻報道方法［12］，收集P4至P5代相同個體來源的SCAP和PDLSCs，分別制成3×106/mL的細胞懸液后分裝于離心管內，并于每1.5 mL細胞懸液內浸入10片HA-TCP支架材料，置搖床上在37℃、50 mL/L CO2環境內以70 r/min振蕩搖晃2 h，待細胞均勻接種粘附后，小心取出支架材料置24孔板內，每孔一片，隨機分為3組，分別按表1所示加入相應的培養體系，連續培養28 d，每2 d換液1次，分別于培養的第1、7、14、21、28 天取出各組樣本，0.01 mol PBS洗3遍，25 mL/L戊二醛固定，乙醇梯度脫水，臨界點干燥，噴金，掃描電鏡觀察。

1.4.3 PL對SCAP和PDLSCs體內移植模式下增殖、分化的影響

參考并改進文獻報道方法［13-14］，收集 P4至P5代相同個體來源的SCAP和 PDLSCs，分別以5×105/皿的密度接種于6 cm直徑培養皿內，待細胞貼壁并生長至融合后，隨機分為3組，分別按表1所示加入相應的培養體系，于37℃、50 mL/L CO2孵箱中培養，每2 d換液1次，連續培養14 d后分別將各組所形成的SCAP和PDLSCs細胞膜片完整刮下并移入另一培養皿，再重復該步驟兩次以獲得3張細胞膜片，小心重疊后包裹于經FBS預濕的HA-TCP支架材料表面。然后取6～8周齡雌性裸鼠，在腹腔注射麻醉下，將上述經細胞膜片包裹的HA-TCP支架材料植入裸鼠背部皮下。常規飼養8周后取材，40 g/L多聚甲醛固定，EDTA脫鈣2周，環氧樹脂包埋后切片，行Van Gieson染色，光學顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 SCAP和PDLSCs的分離、純化和鑒定

原代SCAP和PDLSCs細胞在1～3 d內爬出組織塊，細胞體積較小，多數為成纖維樣細胞，其中SCAP呈梭形或多角形(圖1a);PDLSCs呈均一的細長梭形(圖1b)。克隆化培養并傳至第3代的SCAP和PDLSCs經流式細胞儀檢測(圖2)和免疫細胞化學染色(圖3a，d，e)顯示所獲得細胞在細胞表型上符合SCAP或PDLSCs的特征。成脂誘導5周，倒置相差顯微鏡觀察，可見細胞Oil Red O脂滴染色陽性(圖3b，f);礦化誘導4周，茜素紅染色后，鏡下可見礦化結節形成(圖3c，g)。

2.2 PL對SCAP和PDLSCs復合HA-TCP支架材料體外三維培養模式下增殖的影響

掃描電鏡低倍視野(圖4Ⅰ，Ⅱ)可見在整個培養周期內，除了對照組的PDLSCs外，其余各處理組細胞均能隨培養時間的延長逐漸在HA-TCP支架材料表面和孔隙間形成較為連續完整的細胞膜片樣結構。SCAP各處理組間(圖4Ⅰ)，在培養初期(1～7 d)，細胞膜片的面積和完整度呈現50 mL/L PL組＞10 mL/L PL組＞對照組的規律，提示50 mL/L PL組細胞生長情況優于10 mL/L PL組和對照組;在培養中后期(14～28 d)，因各組樣本表面均為細胞膜片完全覆蓋，故未觀察到明顯差異。PDLSCs各處理組間(圖4Ⅱ)，在整個培養周期的各時間點，細胞膜片的面積和完整度均顯示50 mL/L PL組＞10 mL/L PL組＞對照組，提示PL對PDLSCs的促增殖效應更具濃度相關性。

高倍視野(圖4Ⅲ，Ⅳ)下可見:各處理組SCAP和PDLSCs均能良好的粘附于HA-TCP支架材料表面，伸展充分(圖4Ⅲ A～C;Ⅳ A～C)。SCAP各處理組(圖4Ⅲ)從7 d開始細胞均生長密集至融合，進入復層生長狀態，50 mL/L PL組和10 mL/L PL組均觀察到有明顯的礦化細胞外基質形成，隨著培養時間的延長，對照組從21 d開始也觀察到形成礦化細胞外基質，但是少于同時期的50 mL/L PL組及10 mL/L PL組，提示了 PL對SCAP的促進礦化作用。PDLSCs各處理組(圖4Ⅳ)在7 d時細胞仍圍繞孔隙或跨孔隙交錯生長，未進入復層生長狀態，但50 mL/L PL組及10 mL/L PL組已可觀察到有明顯的礦化細胞外基質形成;直至14 d時50 mL/L PL組及10 mL/L PL組細胞方進入復層生長狀態，而同期的對照組細胞仍保持培養初期的生長狀態;在培養中后期(14～28 d)，相對于對照組，50 mL/L PL組及10 mL/L PL組樣本能夠觀察到更多的礦化細胞外基質，提示了 PL對PDLSCs同樣具有促進礦化的效應。

2.3 PL對SCAP和PDLSCs體內移植模式下異位生成硬組織能力的影響

組織學觀察顯示(圖5)，裸鼠體內移植8周后，經50 mL/L PL及10 mL/L PL體系預刺激的SCAP樣本(圖5A～B)在HA-TCP支架材料表面和孔隙間形成了牙本質牙髓復合體樣結構，可觀察到牙本質樣基質(d)、成牙本質細胞樣細胞(od)和牙髓樣組織(Pulp)，而且50 mL/L PL組形成的牙本質樣基質的連續性和礦化程度均高于10 mL/L PL組;而在對照組(圖5C)，HA-TCP支架材料表面和孔隙內可觀察到成骨細胞(ob)及礦化程度較高的新生骨組織(b)。經50 mL/L PL體系預刺激的PDLSCs樣本(圖5D)可觀察到新生的牙骨質樣基質(C)、成牙骨質細胞樣細胞(CB)和牙周膜樣組織(PDL);而10 mL/L PL組(圖5E)觀察到的是成骨細胞(ob)及礦化程度較高的新生骨組織(b);在對照組(圖5F)除了觀察到條索狀的纖維結締樣組織外，未發現明顯的新生硬組織。提示在體外預刺激后體內移植的模式下，PL對于SCAP和PDLSCs的干預效應具有特定的濃度相關性。

圖2 流式細胞儀分析細胞的表面抗原特征表型，P2，P3表示抗原陽性區域(A為SCAP;B為PDLSCs)

圖4 掃描電鏡觀察SCAP及PDLSCs生長于HA-TCP支架材料上第1、7、14、21、28天的情況

圖5 組織學觀察各組樣本植入裸鼠背部皮下8周后的情況(Van Gieson染色，×100)

3 討論

自我更新和多向分化能力是干細胞的重要特征及突出優勢，但干細胞的這些能力并不是無限的。由于受目前研究技術水平所限，在體外分離、長期大規模培養和應用干細胞的過程中尚不能復制出與體內完全一致的微環境，有可能對干細胞造成各種不利影響，從而使其自我更新及分化能力發生變化甚至逐漸喪失。同時，由于干細胞分化的多向性及其調控機制的復雜性，即使能夠為其營造出定向分化的環境，比如礦化誘導培養體系，可是一旦細胞脫離該環境比如移植進入體內后，就無法很好地對其施加持續的、多因素聯動的分化調控，從而無法保證干細胞一定會向目標細胞分化。雖然目前針對以上問題已進行了諸多研究并取得了一定的進展，但是這些技術手段在實際應用中存在著諸如花費昂貴，操作不便等缺點。因此，考慮建立一種在大規模擴增的同時，亦能維持干細胞特性的培養條件就顯得非常必要。

血小板富集物應用于干細胞培養或臨床治療的嘗試目前已獲得了生物學理論和大量基礎研究成果的支持［9，15］。但僅通過評價血小板富集物在干細胞增殖及促進組織愈合再生方面的作用，尚不能確定其所有的相關機制［19，15-18］。加之目前已報道的各種血小板富集物提取方法差別較大，無法形成規范化的標準流程，所采用的動物模型標準也不一致，更增加了我們從中歸納出較可靠結論的難度。但可以確定的是:研究過程中生長因子的種類、劑量和干預方式起著至關重要的作用［19］。牙源性干細胞分化由諸多與成骨相關的因素調控，包括TGF-β家族成員和其他多種生長因子［20-22］。PL是血小板富集物經細胞裂解后的產物，其去除了殘余細胞結構，降低了免疫原性，保留了其中的多種液態生長因子如 PDGF、TGF-β、FGF、EGF 和正常 T 細胞表達和分泌增強調節因子等，而這些生長因子均被證實能促進骨的再生修復［23-24］。

牙的生長發育也受參與其中的干細胞種類和分化能力的調控，分離自未發育完成恒牙根尖乳頭的根尖牙乳頭干細胞(SCAP)和牙周韌帶組織的牙周膜干細胞(PDLSCs)同為間充質來源干細胞，被認為與牙根相關組織生長發育和再生密切相關。目前已有諸多分別針對這兩種細胞的研究，但是將SCAP和PDLSCs置于同一研究模型內進行比較尚屬探索階段。有鑒于僅僅應用血小板富集物尚無法啟動牙源性干細胞的礦化［9］，本研究立足礦化誘導的微環境，利用體外接種HA-TCP支架材料三維培養和動物體內移植的實驗模型，通過引入PL作為生長因子來源，以期促進SCAP及PDLSCs體內外增殖和成骨-成牙本質定向分化，達到增強組織再生和修復能力的目標。本研究發現:在連續4周的體外三維培養模式下，PL能促進SCAP和PDLSCs的增殖、礦化細胞外基質形成，并有助于在支架材料上形成完整細胞膜片(cell sheet)樣結構。這提示在體外礦化誘導的微環境內，PL的參與更能保持三維生長條件下SCAP和PDLSCs持續自我更新特性，同時增強其礦化能力。利用體外先期持續刺激后再植入體內的模式，觀察到經50 mL/L PL、10 mL/L PL培養體系干預的SCAP能形成了包含成牙本質細胞樣細胞、牙本質樣基質和牙髓組織的牙髓牙本質復合體樣結構;相較對照組僅形成礦化骨樣基質，經PL處理組顯然更符合牙體組織再生的應用目標。同樣，PDLSCs經50 mL/L PL先期刺激后植入體內可分化為成牙骨質細胞樣細胞，并生成牙骨質樣基質和牙周膜樣組織，從而更貼近牙周組織再生要求。以上結果提示，一定體積濃度比的 PL在 SCAP和PDLSCs體內外增殖、定向分化中可能起到促進作用，在牙組織工程領域具有良好的應用前景。

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