清熱解毒方對2型糖尿病模型大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6的干預研究

馮建華 李潔 王殿云 張萌 劉媛 李國霞

糖尿病是一種嚴重威脅人們身體健康的常見內分泌代謝性疾病，2型糖尿病的特征是胰島素抵抗和進行性胰島β細胞功能衰竭，這兩方面可能有著共同的基本發病機制。近幾年的研究表明，炎癥因子與2型糖尿病之間有密切的關系[1-3]。目前，西醫關于糖尿病炎性因子的研究報道較多，而中醫藥針對DM炎性因子的研究鮮見報道。筆者提出了2型糖尿病炎癥因子反應為中醫學“內生之毒”的理論假說，其主要的病因病機為熱毒內盛，基于此理論，選擇以清熱解毒為主的中藥復方，觀察其對鏈脲佐菌素(STZ)糖尿病大鼠血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)水平的干預作用。

1 材料與方法

1.1 動物

健康雄性清潔級Sprague-Dawley( SD) 大鼠60只，體質量250～300 g，由山東省實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK(魯)20050015。山東中醫藥大學實驗動物中心恒溫飼養、造模和觀察。

1.2 動物與試劑

清熱解毒方藥由黃連9 g、黃芩12 g、金銀花30 g、大黃6 g、玄參15 g、生地黃15 g、丹參15 g、西洋參6 g組成，所含的生藥飲片均購自濟南，按照原方比例和制法由山東中醫藥大學試驗藥廠提供；對照品鹽酸二甲雙胍由河北天成藥業有限公司生產。

1.3 儀器

AB -160 型電子分析天平系德國Sartornius公司產品；微量加樣器系法國Gilson公司產品；Elisa酶聯免疫盒(白介素1、白介素6、胰島素、血清腫瘤壞死因子)均系上海藍基生物科技有限公司產品；STZ系美國Sigma公司產品。

1.4 造模與分組

動物模型的建立按 Srinivasan等[4]和周迎生等[5]的方法改良，60只大鼠經適應性喂養3天，隨機分為2組，正常對照組12只，給予普通飲食；造模組48只，給予高脂飲食喂養(基礎飼料加上28%蔗糖，20%熟豬油，1%膽固醇，0.25%膽酸鹽)4周后禁食(不禁水)16小時，一次性腹腔注射低劑量STZ 30 mg/kg(用pH 4.4的0.1 mmol/L無菌檸檬酸緩沖液配成0.25%濃度)；正常對照組注射等體積的0.1 mmol/L的無菌檸檬酸緩沖液。造模組注射STZ 72小時后，尾靜脈采血測血糖大于16.7 mmol/L，即為造模成功。

將造模成功48只動物隨機分為4組，每組12只，即模型組、二甲雙胍組、中藥高劑量組、中藥低劑量組，4組間血糖水平無統計學差異(P>0.05)。中藥高、低劑量組每天上午9：00及下午5：00分別以清熱解毒方灌胃，高劑量組為每只每次2.5 ml，低劑量組為每只每次1.2 ml；二甲雙胍組，每天上午9：00及下午5：00分別給予5%鹽酸二甲雙胍溶液2 ml灌胃；模型組，每天上午9：00及下午5：00分別以蒸餾水2 ml灌胃。共干預4周。

1.5 觀測指標

剪尾取血，采用one-touch(美國強生)血糖儀測定空腹血糖；腹主動脈取血，采用ELISA酶聯免疫試劑盒測定血清TNF-α、IL-1、IL-6水平。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠的血糖情況

造模成功后大鼠血糖升高，與正常組相比差異有顯著統計學意義(P<0.01)，經過藥物干預4周后，中藥高劑量組、中藥低劑量組及二甲雙胍組的血糖水平較模型組均明顯下降(P<0.05)，但中藥高劑量組、中藥低劑量組的血糖水平仍高于二甲雙胍組(P<0.05)。說明清熱解毒方具有降低糖尿病模型大鼠的血糖的作用，但其作用不如二甲雙胍。見表1。

表1 造模成功后各組大鼠的血糖比較()

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01；與二甲雙胍組比較，cP>0.05，但整體血糖水平高于二甲雙胍組；與中藥高劑量組及二甲雙胍組比較，dP<0.05。

2.2 清熱解毒方對糖尿病大鼠外周血TNF-α、IL-1、IL-6的影響

模型組TNF-α顯著高于正常對照組(P<0.05)，中藥高劑量組和中藥低劑量組大鼠的TNF-α水平均顯著低于模型組(P<0.05)，中藥高劑量組、中藥低劑量組之間差異無統計學意義(P>0.05)；中藥高劑量組和低劑量組大鼠的TNF-α水平顯著均低于二甲雙胍組(P<0.05)。說明糖尿病大鼠存在TNF-α、IL-1和IL-6的升高，清熱解毒方藥高劑量和低劑量均能降低其TNF-α含量，不同劑量效果沒有差異，其降低TNF-α、IL-1和IL-6的功效優于二甲雙胍。見表2。

模型組IL-1顯著高于正常對照組(P<0.05)；中藥高劑量組和中藥低劑量組大鼠的IL-1水平均顯著低于模型組(P<0.05)；中藥高劑量組與中藥低劑量組之間差異無統計學意義(P>0.05)，2組均顯著低于二甲雙胍組(P<0.05)。見表2。

表2 清熱解毒方對糖尿病大鼠外周血TNF-α、IL-1和IL-6的影響

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與二甲雙胍組比較，bP<0.05；與中藥高劑量組比較，cP<0.05。

模型組IL-6顯著高于正常對照組(P<0.05)，中藥高劑量組和中藥低劑量組大鼠的IL-6水平均顯著低于模型組(P<0.05)；且中藥高劑量組的IL-6水平顯著低于中藥低劑量組(P<0.05)，2組均顯著低于二甲雙胍組(P<0.05)。見表2。

3 討論

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素1(IL-1) 和白介素6(IL-6)均是重要的細胞因子，研究證實大量TNF-α作用于胰島β細胞，可造成β細胞的DNA損傷，而且TNF-α還可通過白介素1(IL-1)及一氧化氮(NO)途徑，抑制胰島素作用，促進β細胞損傷，另一方面TNF-α作用于肝細胞、脂肪細胞等，使胰島素受體底物-1的絲氨酸殘基磷酸化，抑制正常胰島素傳導途徑，間接影響胰島素敏感性[6]。本課題組的前期臨床研究結果顯示：2型糖尿病患者血清TNF-α、IL-1、IL-6水平較正常人明顯升高(P<0.05)，且伴有血管并發癥的糖尿病患者血清TNF-α、IL-1、IL-6水平明顯高于無并發癥的患者(P<0.05)。經清熱解毒方治療后可降低2型糖尿病患者血清TNF-α、IL-1和IL-6水平，改善血糖、糖基化血紅蛋白、血清胰島素等指標，并顯著改善患者癥狀體征[7]。

炎癥因子既是病理產物又是致病因素，我們從中醫理論的角度提出了“內生之毒”的假說觀點，毒邪內盛是消渴病(糖尿病)及其并發癥發生發展的基本病理機制。正如《靈樞·五變篇》謂：“怒則氣上逆，胸中蓄積，血氣逆留，髖皮充肌，血脈不行，轉而與熱，熱則消肌膚，故為消癉?！薄兜は姆āは省分赋觯骸熬泼鏌o節，酷嗜炙旸……于是炎火上熏，臟腑生熱，燥熱熾盛，津液干焦，渴飲水漿，而不能自禁?！边@就從病理方面指出胃腸熱結，毒邪內生，耗傷津液是消渴病發病的主要機理。根據“熱者寒之”、“溫者清之”、“治熱以寒”的治療原則，采用以黃連、黃芩、金銀花、生地黃、玄參、大黃等清熱解毒為主的中藥組成基本方，對中醫辨證為肺胃熱盛者2型糖尿病患者進行了臨床干預研究，取得了初步臨床療效[7]。方中的藥物除具有清熱解毒作用外，現代藥理研究表明還具有抗病原微生物、抗炎、免疫抑制和調節血糖等作用。

本研究顯示，模型組大鼠外周血中TNF-α、IL-1、IL-6水平均明顯高于正常組，經清熱解毒方干預后均顯著下降，且優于二甲雙胍組。本研究證實了清熱解毒為主的中藥復方可抑制糖尿病模型大鼠的TNF-α、IL-1、IL-6水平，降低血糖；研究為驗證炎癥因子反應為“內生之毒”的理論假說提供了一定的依據，為清熱解毒治療2型糖尿病找到了理論根據和客觀依據。但對其具體作用機制尚有待于進一步深入研究。

參考文獻

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[2] Barzilay JI，Abraham L，Heckbert SR，et al．The relation of markers of inflammation to the development of glucose disorders in the elderly:the Cardiovascular Health Study[J]．Diabetes，2001,50(10):2384-2389．

[3] Pradhan AD，Manson JE , Rifai N，et a1．C-reactive protein . interleukin 6,and risk of developing type 2 diabetes mellitus[J].Jama,2001,286(3):327-334．

[4] Srinivasan K, Viswanad B, Asrat L, et al. Combination of high-fat diet-fed and low-dose strep tozotocin-treated rat: a model for type 2 diabetes and pharmacological screening[J]. Pharmacol Res, 2005,52 (4) : 313-320.

[5] 周迎生,高妍,李斌,等.高脂喂養聯合鏈脲佐菌素注射的糖尿病大鼠模型特征[J].中國實驗動物學報,2005,13 (3) :154-158.

[6] O’Doherty R, Stein D, Foley J. Insulin resistance[J].Diabetologia, 1997,40(suppl3):B10-5.

[7] 張萌，馮建華，張昭.清解合劑對2型糖尿病炎癥因子水平的影響[J].山東中醫藥大學學報，2009，33(6)：486-488.