椒梅連理湯抗慢性潰瘍性結腸炎的實驗研究

周春和 高玉華 高社光 王玲玲 宋立峰 申煒 郭興芳 李志斌 劉娜

潰瘍性結腸炎是一種原因不明的反復發作的慢性非特異炎癥性腸道疾病。目前普遍認為其發病與免疫功能紊亂有關[1-3]，因此具有免疫調節作用的細胞因子在其發病過程中起著不可忽視的作用。筆者采用椒梅連理湯治療該病，療效顯著。為進一步研究該方發生作用的機理，制作潰瘍性結腸炎大鼠模型，以椒梅連理湯作為處理因素，觀察其對模型大鼠細胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF級SD大鼠43只，體重(220±20)g，適應性飼養3天后按體重順序編碼，用隨機數字表法將其分為4組：正常組10只，模型組、柳氮磺胺吡啶組(SASP組)、椒梅連理湯組(中藥組)各11只。

1.2 試劑與器材

5%三硝基苯磺酸(TNBS)溶液由美國Sigma公司生產。水合氯醛為國產分析純。無水乙醇。白介素1β(IL-1β),白介素4(IL-4)，白介素6(IL-6)試劑盒，大鼠TNF-α酶聯免疫雙抗體夾心(ABC-ELISA)試劑盒，由北京普爾偉業生物科技有限公司提供。日立高速冷凍離心機。奧林巴斯雙目光學顯微鏡。

1.3 造模方法

正常組不造模，其余3組于造模前禁食48小時，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉。將大鼠尾部抬高，約呈40°角，將5%三硝基苯磺酸(TNBS)與無水乙醇以2∶1的體積混合，將一外徑2.0 mm輸液管緩慢從大鼠肛門插入約8 cm，緩慢灌注以上混合液0.6 ml，捏緊肛門放置5分鐘，等待大鼠自然蘇醒。造模結束后第2天各造模組隨機處死1只大鼠，肉眼觀察其結腸情況，并取8 cm腸段做HE染色，光鏡下觀察，確定造模成功。

1.4 藥物及給藥方法

造模后3天開始給藥，連續4周。椒梅連理湯組(中藥組)予中藥灌胃，由邯鄲市中醫院中藥房提供。椒梅連理湯組成：川花椒6 g、烏梅15 g、川黃連15 g、黨參12 g、麩炒白術15 g、干姜6 g、炙甘草10 g。加10倍量水煎煮，濃縮，按成人用量的8倍量，灌胃容積為1 ml/100 g體重，每天1次。

柳氮磺胺組(SASP組)予柳氮磺胺混懸液灌胃。柳氮磺胺吡啶片由上海三維制藥有限公司提供，國藥準字H31020450。將其研磨成細粉，使用時用蒸餾水配成混懸液，按0.267 g/kg，灌胃容積為1 ml/100 g體重(相當于成人用量的8倍)，每天1次。

正常組及模型組給予蒸餾水，按1 ml/100 g體重灌胃，每天1次。

1.5 觀察指標

所有動物均飼養4周，觀察記錄大鼠糞便、毛發、精神等一般狀況。取材前禁食水12小時，10%水合氯醛麻醉，開腹，腹主動脈取血，靜置2小時，3000 rpm離心10分鐘，取血清備用。肉眼觀察大鼠結腸形態，肛門以上8 cm剪取病變最明顯處結腸段，取組織100 mg加入生理鹽水1 ml，研磨制作成勻漿，于4 ℃ 3000 rpm離心取上清液備用。放射免疫分析法測定各組血清及組織勻漿IL-1β、IL-4、IL-6含量，ELISA法測定TNF-α含量。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 大鼠一般狀況

模型組動物精神萎靡，活動減少，毛發干枯無光澤，顏色發黃，進食減少，排稀便，部分帶有膿液或黏液血便，肛周污穢。SASP組和中藥組大鼠在第1周同模型組，第2～3周逐漸好轉，第4周時精神好轉，活動較多，毛發比較光亮，糞便基本恢復正常。

2.2 大鼠結腸黏膜損傷大體情況

肉眼觀察模型組結腸黏膜充血、水腫，黏膜表面有膿血黏液。可見局部糜爛，或局部有橢圓形淺表潰瘍，潰瘍間黏膜水腫而增厚，某些病變區域顏色黑褐。SASP組和中藥組較模型組充血水腫不明顯，結腸黏膜顏色與正常組相似，未見明顯潰瘍。

2.3 對大鼠血清IL-1β、IL-4、IL-6及TNF-α的影響

模型組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量較正常組顯著升高(P<0.05)，中藥組及SASP組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量則顯著低于模型組(P<0.05)，2組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。模型組IL-4含量較正常組降低(P<0.05)，中藥組及SASP 組含量高于模型組(P<0.05)，2組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表1。

2.4 對大鼠結腸黏膜組織中IL-1β、IL-4、IL-6及TNF-α的影響

模型組IL-1β、IL-6、TNF-α含量較正常組升高(P<0.05) ；中藥組及SASP 組含量低于模型組(P<0.05)，2組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。模型組IL-4低于正常組(P<0.05)，中藥組及SASP 組含量較模型組升高(P<0.05)，2組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表2。

3 討論

潰瘍性結腸炎發病機制之一可能是由于腸黏膜通透性增加，導致腸腔內特異性抗原進入黏膜下肌層，引起的結腸損傷。基于以上理論，采用TNBS和乙醇混合造模，乙醇破壞腸黏膜屏障，輔助TNBS進入腸黏膜而致炎。本研究顯示造模后動物出現排稀便、膿液和黏液血便等，病理檢查示結腸潰瘍、腸壁充血水腫、炎性細胞滲出等，與潰瘍性結腸炎患者臨床表現和病理變化類似。因此筆者認為采用該方法造模成功。

IL-1主要有IL-α和IL-β兩種形式，其中IL-β主要為分泌型的。它的分泌可介導潰瘍性結腸炎的早期的炎癥反應。它能夠促進炎癥活性，刺激其他細胞因子和炎癥介質產生，增加單核-巨噬細胞等的抗原提呈能力，促進B細胞的增殖和分化，介導免疫球蛋白的分泌，激活補體和殺傷細胞等的活性，增強細胞免疫和體液免疫。IL-6是由活化的T細胞和成纖維細胞產生的淋巴因子，也是一種促炎癥因子，它與其他細胞因子一起，可通過誘導T細胞活性，促進炎癥的發生，參與了潰瘍性結腸炎的發病與遷延。其升高程度與局部炎癥程度相一致。IL-4主要由活化的巨噬細胞和淋巴細胞分泌，有研究表明IL-4可以抑制單核巨噬細胞產生IL-β和TNF-α，具有抑制炎癥的作用，可以緩解炎癥。正常人黏膜的淋巴細胞比外周血淋巴細胞分泌更多的IL-4， 也表明其對于維持腸道的免疫功能起著重要的作用[1-2]。TNF-α 是公認的能介導潰瘍性結腸炎發病的細胞因子之一，與T淋巴細胞及其他一些細胞因子構成復雜的免疫調節網絡。它主要通過使中性粒細胞聚集、內皮粘附分子上調、凝血酶原效應等參與UC 的發病，還可通過激活轉錄因子核因子kB通路，上調IL-6等促炎介質的表達，促進炎癥的發生與遷延[3]。

表1 椒梅連理湯對潰瘍性結腸炎大鼠血清IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α的影響

本研究顯示模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平較正常組明顯升高，IL-4水平較正常組降低，說明模型大鼠存在炎性細胞因子(促炎因子與抗炎因子)的失衡，經治療后，IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低，IL-4水平升高，差異有統計學意義，說明中藥和SASP均能調整炎性因子水平，糾正其失衡狀態，從而改善腸道炎癥，起到抗炎，修復潰瘍損傷的作用，兩者作用相當。李楠等[4]研究也有相類似的結果，復方血竭能抑制潰瘍性結腸炎大鼠IL-1β、IL-6水平，上調IL-4和IL-10水平。

潰瘍性結腸炎發病有因情志不暢，或飲食不節致邪滯于腸，氣血壅滯，腸道傳導失司，脂絡受傷，腐敗化為膿血或素體陰盛，外感寒濕，內傷飲食，遷延日久，脾虛濕盛、寒熱夾雜之證[5]。常因過勞、受冷或飲食不節而加重。治療寒熱并調為主，并健脾祛濕。本研究自擬椒梅連理湯治療，方中川花椒、烏梅、黃連助陽益腎，調節寒熱；黨參可以益氣健脾，麩炒白術可以燥濕健脾，干姜溫中散寒，炙甘草和中緩急，以達到溫運脾濕、調和寒熱的作用。諸藥合用，對潰瘍性結腸炎有較好的療效。

本研究結果提示椒梅連理湯能有效對抗實驗性潰瘍性結腸炎，與SASP相當，通過調節IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4含量，調整炎性因子，糾正機體異常免疫功能，消除炎癥，促進組織修復，可能是其治療機制之一。

參考文獻

[1] 口鎖堂，吳煥突，施仁達.白介素與潰瘍性結腸炎[J].世界華人消化雜志，2006,18(4)：405-411.

[2] 張素珍，張德純.潰瘍性結腸炎發病的免疫學機制[J].國際檢驗學雜志，2006,27(5)：419-421.

[3] 施嫣紅.潰瘍性結腸炎的免疫學研究進展[J].疾病控制雜志，2006，10(3):302-304.

[4] 李楠，王雪明，翟俊山，等.復方血竭對潰瘍性結腸炎大鼠模型結腸組織細胞因子的調節作用[J].中國實驗方劑學雜志，2008,14(1)：377-379.

[5] 朱潔梅，李春婷.中藥內治潰瘍性結腸炎淺議[J].環球中醫藥，2011，4(1)：43-45.