EDTA依賴性假性血小板減少的臨床和實驗室分析

李 波，史 敏，宋 軍，高羽高，王 燕

（1.河北省石家莊市疾病預防控制中心預防性健康體檢所，河北石家莊 050011；

2.河北醫科大學第二醫院檢驗科，河北石家莊 050000）

·論 著·

EDTA依賴性假性血小板減少的臨床和實驗室分析

李 波1，史 敏2*，宋 軍2，高羽高2，王 燕2

（1.河北省石家莊市疾病預防控制中心預防性健康體檢所，河北石家莊 050011；

2.河北醫科大學第二醫院檢驗科，河北石家莊 050000）

目的對乙二胺四乙酸依賴性假性血小板減少癥（ethylene diamine tetraacetic acid-dependent pseudothrombocytopenia，EDTA-PTCP）患者進行臨床和實驗室分析，并初步探討其產生機制。方法比較儀器法測定及手工法計數的血小板結果；采用瑞-姬染色法觀察D抗凝和不抗凝血涂片中血小板形態；采用間接免疫熒光法檢測免疫球蛋白抗體IgG、IgA和IgM。結果①EDTA-PTCP的發生率為1.17%，多發生于老年人，與性別無關，心血管疾病患者的發生率較高；②EDTA-K2抗凝血在血細胞分析儀上測定的血小板計數值［（41.15±19.1）× 109/L］明顯低于手工法計數血小板計數值［（181.6±75.3）×109/L］（P＜0.05）；③假性血小板減少癥（pseudothrombocyto penia，PTCP）患者EDTA抗凝血涂片與不抗凝血涂片中血小板形態明顯不同；④PTCP患者多表達IgG或IgM抗血小板抗體。結論應用血細胞計數儀測定EDTA抗凝血可引起PTCP的發生，這可能與自身抗體IgG或IgM的存在有關。

血小板減少；血小板計數；抗血小板聚集抑制劑

KEY WORDS：thrombocytopenia；platelet count；platelet aggregation inhibitors

近年來，由多種原因引起的乙二胺四乙酸依賴性假性血小板減少癥（ethylene diamine tetraacetic acid-dependent pseudothrombocytopenia，EDTAPTCP）常見報道［1］。PTCP是一種由抗凝劑在體外激活血小板發生凝集反應，從而導致血小板計數假性降低的現象，本身并無病理意義［2］。EDTA鹽能有效保持細胞形態和防止血小板聚集，是國內外全自動血液分析儀普遍采用的一種抗凝劑，但少數情況下有可能導致 PTCP，即 EDTA依賴性 PTCP（EDTA-PTCP）。對PTCP的認識不足常會導致不必要的實驗室檢測、延誤治療以及由此引發輸血并發癥［3］。為探討其發生原因，本文對895例健康體檢者及1 250例住院患者進行了血小板計數觀察，并對其中出現EDTA-PTCP的25例患者進行了臨床和實驗室分析。

1 資料與方法

1.1 研究對象：選取2008年3月—2010年3月住院患者1 250例，健康體檢者895例，在進行血常規分析時，對血小板計數＜100×109/L的標本進行涂片鏡檢，其中鏡檢發現血小板聚集成團的，與計數明顯不符的，即為EDTA-PTCP，定為實驗標本。

1.2 方法：儀器包括全自動血細胞分析儀（CD3700，美國雅培公司），熒光顯微鏡（XSP-08/ YZ-1，日本OLYMPUS公司），光學顯微鏡（CX21，日本OLYMPUS公司），牛鮑計數盤（江蘇鹽城錦輝玻璃儀器廠），EDTA-K2真空采血管（威海鴻宇醫療器械有限公司），37℃溫箱（無錫瑞智科技有限公司），搪瓷桶3只（內有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1 500mL），有蓋搪瓷盒1只（內鋪一層浸濕的紗布墊），玻片架，濾紙。試劑包括全自動血細胞分析儀配套試劑，草酸銨稀釋液，瑞-姬染液，磷酸鹽緩沖液，0.01mol/L，pH7.4；緩沖甘油，分析純無熒光的甘油9份和0.2mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.2）1份配制；熒光標記的多克隆兔抗人免疫球蛋白抗體（IgG，IgM，IgA）（Abcam公司），以0.01mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液1∶200進行稀釋。

1.2.1 儀器法：安靜狀態下順利抽取5mL靜脈血，其中2mL靜脈血加入到EDTA-K2抗凝管中，立即混勻，1h內在血細胞分析儀上檢測血小板計數；3mL靜脈血靜置2h，3 000r/min離心10min，留取血清檢測血小板抗體。

1.2.2 手工法：取靜脈血20μL加入到0.38mL草酸銨的稀釋液中，按照《全國臨床檢驗操作規程》第3版的操作方法進行血小板手工計數。

1.2.3 血涂片鏡檢：在抽取靜脈血同時，取10μL血立即涂片，作為涂片A，再用EDTA-K2抗凝血進行涂片，標為涂片B，行瑞-姬染色后，在油鏡下觀察血小板分布情況。

1.2.4 間接免疫熒光法檢測抗體：①滴加0.01mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液于已知抗原標本片，10min后棄去，使標本片保持一定濕度。②滴加以0.01mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液200倍稀釋的待檢抗體標本，覆蓋已知抗原標本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內，37℃保溫30min。③取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液沖洗1～2次，然后按順序過0.01mol/L、pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不時振蕩。④取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，滴加一滴1∶200稀釋的熒光標記的抗人球蛋白抗體。⑤將玻片平放在有蓋搪瓷盒內，37℃保溫30min。⑥重復操作3。⑦取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。⑧熒光顯微鏡高倍視野下觀察。

1.3 結果判定：（ -）無熒光；（ ±）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見；（ ++）熒光明亮；（+++ ～ ++++）熒光閃亮。待檢標本特異性熒光染色強度達“++”以上，而各種對照顯示為（±）或（-），即可判定為陽性。

1.4 統計學方法：應用SPSS13.0統計軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 EDTA-PTCP的發生率及臨床分析：1 250例住院患者中發生EDTA-PTCP 23例（1.84%），健康體檢者895例中發生2例（0.22%），25例EDTAPTCP中，男性14例，女性11例，年齡25～71歲，平均52.4歲。其中＜40歲有8例，≥40歲17例；心血管疾病13例，惡性腫瘤2例，肝臟疾病4例，免疫性疾病2例，重癥感染4例。

2.2 血小板2種計數方法的比較：使用EDTA-K2抗凝管在血細胞分析儀上測定的血小板計數值為（41.15±19.1）×109/L，手工法計數血小板計數值為（181.6±75.3）×109/L，EDTA-K2抗凝管血小板計數值明顯高于手工法計數血小板計數值，二者差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 血小板形態學檢查：涂片經瑞-姬染色在油鏡下觀察顯示，涂片A中血小板數量較多，呈自然成堆分布，且血小板形態清晰（圖1A）。涂片B中血小板明顯聚集成簇，甚至聚集成大片狀，血小板數10～50個不等，且血小板形態模糊，邊界不清，多融合在一起，易聚集于中性粒細胞周圍（圖1B）。

2.4 免疫球蛋白抗體的檢測：IgG，IgM，IgA抗體在25例EDTA-PTCP患者中表達有所不同，其中IgG 8例，IgM 14例，IgA 3例。

圖1 患者外周血血小板形態學A.不抗凝血血小板；B.EDTA抗凝血血小板Figure 1 Platelete morphology in patient′s peripheral blood smear A.non-anticoagulated blood；B.EDTA-anticoagulated blood

3 討 論

本研究結果顯示，在健康體檢者和住院患者中EDTA-PTCP的發生率較少（1.17%），心血管疾病患者的發生率較高；PTCP患者EDTA抗凝血涂片與不抗凝血涂片中血小板形態明顯不同；PTCP的發生機制可能與自身抗體IgG或IgM的存在有關。

血小板在體內主要參與止血與血栓形成，有著非常重要的生理功能，是臨床最常用的檢驗項目之一，因此血小板數量檢測的準確度至關重要。目前血小板的檢測方法主要是應用血細胞分析儀對抗凝血進行檢測。抗凝劑的種類多樣，而EDTA-K2抗凝劑是國際血液標準化委員會推薦的首選抗凝劑，其不影響血細胞形態，并可抑制血小板的聚集，在血液分析儀中廣泛應用。國外報道EDTA-PTCP的發生率為0.07% ～0.20%，住院患者的發生率為1.9%，而且未發現與年齡、性別有關［4］。PTCP的發生與臨床用藥治療及機體自身情況有關。有研究［5］發現這種現象常發生于重癥患者，與自身免疫疾病、腫瘤形成、心血管疾病或慢性肝臟病、病毒感染或膿毒癥有關。本研究結果顯示，住院患者PTCP的發生率為1.84%，健康體檢者PTCP的發生率為0.22%，男性與女性的發生率相近，多為老年人；25例EDTA-PTCP患者中，心血管疾病13例，惡性腫瘤2例，肝臟疾病4例，免疫性疾病2例，重癥感染4例。表明EDTA-PTCP多發生于老年人，與性別無關，心血管疾病患者的發生率較高。

本研究結果還顯示，PTCP患者EDTA抗凝血涂片與不抗凝血涂片中血小板形態明顯不同，EDTA抗凝血涂片中的血小板明顯聚集成簇，甚至聚集成大片狀，血小板10～50個，且血小板形態模糊，邊界不清，多融合在一起，易聚集于中性粒細胞周圍，而非抗凝血血涂片則為自然成堆分布。這可能與血小板結合的抗體Fc段和單核細胞或淋巴細胞膜上Fc受體結合有關。在這種情況下，很可能影響血細胞分析儀對血小板計數及白細胞的分類，導致血小板假性降低。所以，對于在機測血小板結果＜100× 109/L、且無明顯的出血傾向如鼻出血、牙齦出血、紫癜、瘀點、瘀斑等體征且無法解釋血小板減少原因的患者，做血涂片進行初步觀察，如發現有血小板聚集、堆積和發生衛星現象等情況時，應采指血用毛細血管模式測定，或用顯微鏡手工計數檢測，以得出真實性的血小板計數，為臨床提供準確可靠的實驗數據，避免因假性血小板減少所造成的誤診。

PTCP是由免疫學介導的，在血液學中存在EDTA依賴性抗血小板抗體而導致的血小板聚集現象。抗血小板抗體通常為IgG或IgM，很少為IgA，這些抗體可以與來自正常個體的血小板發生反應［6］。它們可能與某些隱藏的通常不能被檢測到的表面抗原發生反應，主要表達于衰老或被破壞的血小板膜上。有研究［7］證實這些抗體不與患有Glanzamann′s病（即缺乏GpⅡb/Ⅲa復合物）的血小板反應，說明與EDTA依賴的抗體反應的物質應包含GpⅡb/Ⅲa。在一些患者中發現一些自身抗體可以特異性地與GpⅡb發生反應，GpⅡb通常隱藏在GpⅡb/Ⅲa復合物中，但經過EDTA與鈣離子鰲和作用，GpⅡb/Ⅲa復合物分裂，GpⅡb暴露出來，與血小板抗體反應，這種現象與低溫引起的血小板結構改變有關［8］。本研究對PTCP患者進行檢測，發現存在抗IgG抗體者8例，IgM抗體10例，IgA抗體3例，大都表現IgG或IgM抗體，與文獻報道一致［6］。提示 IgG或 IgM抗體的存在可能是發生EDTA-PTCP的機制之一。

綜上所述，應用血細胞計數儀可引起PTCP的發生，可能與自身抗體IgG或IgM的存在有關。如果在臨床工作中此種現象未被及時發現，往往會給患者的診斷和治療帶來諸多麻煩，甚至會引起醫療糾紛，因此及時發現尤為重要。這就需要檢驗工作者具備一定的責任心，當在臨床工作中遇到血小板減少的患者時，首先應仔細檢查人為因素和客觀因素，排除采血不當、抗凝管用錯等原因造成的血小板減少，其次做血涂片進行瑞-姬染色，觀察細胞形態，一旦發現血小板聚集、堆積和發生衛星現象等情況，與機器計數明顯不符，再做人工血小板計數。丁胺卡那霉素能有效解離凝集的血小板，作用機制可能與抑制患者血小板膜表面CD62p、PAC21和IgG的表達有關［9］，因此PTCP患者血常規樣品抽血后1h內加入丁胺卡那霉素，有助于解決EDTA所致的血小板數的假性減少。

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（本文編輯：劉斯靜）

THE CLINICAL AND LABORATORY ANALYSIS OF EDTA-DEPENDENT PSEUDOTHROMBOCYTOPENIA

LI Bo1，SHI Min2*，SONG Jun2，GAO Yugao2，WANG Yan2
（1.Department of Health Examination，Shijiazhuang Center for Disease Control and Prevention，Shijiazhuang 050011，China；2.Department of Clinical Laboratory，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China）

Objective To analyze the clinical information and laboratory examinations in patients with ethylene diamine tetraacetic acid-dependent pseudothrombocytopenia（EDTA-PTCP）and to explore its mechanism.MethodsThe results of platelet count between instrumental and manual method were compared；The platelet morphology in blood smears of EDTA-anticoagulant and nonanticoagulant was examined using Wright-Giemsa staining.IgG，IgA and IgM immunoglobulin antibodies were detected using indirect immunofluorescence method.Results①The incidence rate of EDTAPTCP was 1.17%and EDTA-PTCP mostly occured in older people regardless of gender，the incidence rate of EDTA-PTCP patients with cardiovascular disease was higher.②The platelet count of EDTA-K2anticoagulated blood using blood cytoanalyzer method was significantly lower than that of the manual method.③The platelet morphology in blood smears of EDTA-anticoagulant was significantly different from that in non-anticoagulant.④Patients with PTCP mostly express anti-platelet IgG or IgM antibodies.ConclusionPTCP may occur when EDTA anticoagulated blood is used and measured by blood cytoanalyzer method，which may be related to IgG or IgM autoantibodies.

R446.1

A

1007-3205（2012）09-1028-04

2012-02-02；

2012-04-25

李波（1971-），男，河北晉州人，河北省石家莊市疾病預防控制中心副主任檢驗師，醫學學士，從事醫學檢驗研究。

*通訊作者。E-mail：sm8344@hotmail.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.09.014