胰島素抵抗心肌細(xì)胞模型的建立與評價(jià)

王 梅，李擁軍，劉素云，張 輝，楊 蓉，苗成龍

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心血管內(nèi)四科，河北石家莊 050000）

·論 著·

胰島素抵抗心肌細(xì)胞模型的建立與評價(jià)

王 梅，李擁軍*，劉素云，張 輝，楊 蓉，苗成龍

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心血管內(nèi)四科，河北石家莊 050000）

目的建立胰島素抵抗心肌細(xì)胞模型。方法原代培養(yǎng)2～3d SD大鼠心肌細(xì)胞分為對照組、葡萄糖組（glucose，G）、胰島素組（insulin，Ins）、葡萄糖+胰島素組（G+Ins）。在干預(yù)24h和48h后評價(jià)細(xì)胞的胰島素敏感性，檢測脂聯(lián)素表達(dá)。結(jié)果干預(yù)48h后，Ins組、G+Ins組心肌細(xì)胞3H-D-葡萄糖摻入率分別為（12.46±1.11）nmol·mg-1·h-1、（10.61±1.14）nmol·mg-1·h-1，均較對照組的（14.06±0.43）nmol·mg-1·h-1顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù)48h后，Ins組、G+Ins組心肌細(xì)胞脂聯(lián)素mRNA表達(dá)分別為0.35±0.04、0.38±0.04，均較對照組的0.77±0.08顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對照組、G組、Ins組、G+Ins組3H-D-葡萄糖摻入率與心肌細(xì)胞脂聯(lián)素mRNA表達(dá)量均呈顯著正相關(guān)（r=0.92、0.82、0.89、0.86，P均＜0.05）。結(jié)論應(yīng)用高胰島素誘導(dǎo)法、高葡萄糖+高胰島素共同誘導(dǎo)法均可建立胰島素抵抗心肌細(xì)胞模型；胰島素抵抗下調(diào)心肌細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)水平；胰島素抵抗心肌細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)水平與胰島素抵抗呈正相關(guān)。

肌細(xì)胞，心臟；胰島素；模型，動(dòng)物

胰島素抵抗是2型糖尿病、肥胖、高血壓等多種疾病的共同病理生理學(xué)基礎(chǔ)，其代表性特征是高胰島素血癥、高血糖和內(nèi)環(huán)境紊亂。建立相應(yīng)的模型系統(tǒng)有利于在細(xì)胞及分子水平深入研究胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制。目前，較為成熟的胰島素抵抗體外細(xì)胞模型主要有地塞米松誘導(dǎo)模型、游離脂肪酸誘導(dǎo)模型、腫瘤壞死因子誘導(dǎo)模型等，但均局限在脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞，針對心肌細(xì)胞的胰島素抵抗細(xì)胞模型國內(nèi)外未見報(bào)道。本研究應(yīng)用高葡萄糖、高胰島素、高葡萄糖加高胰島素法誘導(dǎo)建立胰島素抵抗心肌細(xì)胞模型，旨在為進(jìn)一步研究心肌細(xì)胞胰島素抵抗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：2～3d的Sprague-Dawley（SD）大鼠（河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）32只。

1.2 藥品與試劑：DMEM低糖培養(yǎng)液、D-Hanks、Ⅱ型膠原酶干粉、Trizol均為GIBCO公司產(chǎn)品；胰蛋白酶干粉為Hyclone產(chǎn)品；新生牛血清、D-甘露醇、牛胰島素、多聚甲醛為 Sigma公司產(chǎn)品；雙抗為Invitrogen產(chǎn)品；BrdU為Boster產(chǎn)品；多聚賴氨酸為Amresco產(chǎn)品；APN抗體為Abcam產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增試劑為Promega產(chǎn)品；RT-PCR檢測試劑盒為大連寶生工程有限公司產(chǎn)品；引物由上海生工生物工程有限公司合成；瓊脂糖為北方同正產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。混合酶消化液配置方法，胰蛋白酶干粉0.08g，Ⅱ型膠原酶干粉0.032g，加入37℃預(yù)熱的D-Hanks液至80mL，勻，過濾除菌，即用即配。

1.3 心肌細(xì)胞培養(yǎng)：取新生2～3d的SD大鼠，在無菌的條件下，開胸取出心臟，用D-Hanks液沖洗3次后剪成約1mm3大小的碎塊，加入混合酶消化液，取消化完畢后的上清液，200目細(xì)胞網(wǎng)篩過濾，所得細(xì)胞懸液差速貼壁后以1×106/mL的密度接種于6孔板，加入5-溴脫尿苷0.1 mmol/L，在二氧化碳孵育箱內(nèi)以含10%血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組：常規(guī)進(jìn)行心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)48h后，換為無血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，之后分為4組，每組8只。①對照組（control），以低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。②葡萄糖組（glucose，G），以30mmol/L葡萄糖干預(yù)。③胰島素組（insulin，Ins），以10-7mmol/L胰島素干預(yù)。④葡萄糖+胰島素組（G+Ins），以30mmol/L葡萄糖和10-7mmol/L胰島素共同干預(yù)。

1.5 胰島素抵抗心肌細(xì)胞模型的鑒定：采用3HD-葡萄糖摻入實(shí)驗(yàn)評價(jià)細(xì)胞的胰島素敏感性。上述各組心肌細(xì)胞根據(jù)干預(yù)時(shí)間不同再分為24h組（干預(yù)24h）和48h組（干預(yù)48h），每組3孔。干預(yù)結(jié)束后，各組加入1mL低糖DMEM培養(yǎng)液再孵育半小時(shí)，然后加入3H-D-葡萄糖繼續(xù)孵育1h。洗滌細(xì)胞后將細(xì)胞溶解，取100μL測定蛋白質(zhì)濃度。冷乙醇（660μL/mL）溶液洗滌2次，離心棄上清，將沉淀物置于濾紙片上，洗滌后烤干，置于10mL閃爍液中，用液體閃爍儀測定放射性計(jì)數(shù)，得出3H-D-葡萄糖摻入率，單位為nmol·mg-1·h-1。

1.6 檢測心肌細(xì)胞脂聯(lián)素的表達(dá)

1.6.1 RT-PCR檢測脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)：引物序 列 為 脂 聯(lián) 素 正 義 鏈 5′ -CAGGAGATGCTGGAATGA-3′，反義鏈 5′-GATACTGGTCGTAGGTGAAG-3′；β-actin正義鏈5′-AGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，反義鏈5′-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3′。按照Trizol試劑說明書提取心肌細(xì)胞總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，共35個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物10μL經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色、照相并經(jīng)光密度儀掃描分析，以βactin光密度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正，計(jì)算APN產(chǎn)物的相對量。

1.6.2 心肌細(xì)胞脂聯(lián)素蛋白表達(dá)水平的檢測：裂解液裂解細(xì)胞后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。利用水浴式電印跡法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，室溫下封閉4h后，加入兔抗APN多克隆抗體稀釋液，4℃過夜，用含體積分?jǐn)?shù)為0.5%Tween-20的磷酸緩沖液洗3遍，再加入熒光染料標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶5 000，Rockland IRDye800CW）二抗稀釋液，37℃振 1h后用磷酸緩沖液洗 3遍，用Odyssey9120雙色紅外激光成像系統(tǒng)儀器掃描PVDF膜后用成像分析軟件進(jìn)行分析，計(jì)算每組與β-actin表達(dá)量的比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)，兩變量間相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細(xì)胞3H-D-葡萄糖摻入率的變化：干預(yù)24h和48h后，G組心肌細(xì)胞3H-D-葡萄糖摻入率與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Ins組、G+Ins組心肌細(xì)胞3H-D-葡萄糖摻入率均較對照組顯著下降（P＜0.05）。見表1。

2.2 心肌細(xì)胞脂聯(lián)素mRNA和蛋白表達(dá)的變化：應(yīng)用高糖、高胰島素、高糖+高胰島素干預(yù)48h后，G組心肌細(xì)胞脂聯(lián)素mRNA表達(dá)與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Ins組、G+Ins組心肌細(xì)胞脂聯(lián)素mRNA表達(dá)均較對照組顯著下降（P＜0.05）。G組、Ins組、G+Ins組心肌細(xì)胞脂聯(lián)素蛋白表達(dá)均較對照組顯著下降（P＜0.05）。見表2。

表1 干預(yù)24、48h后心肌細(xì)胞3H-D-葡萄糖摻入率的變化Table 1 IncorPoration rate of3H-D-glucose in different grouPs of myocardial cells after 24，48-hour treatment（n=8，±s，nmol·mg-1·h-1）

表1 干預(yù)24、48h后心肌細(xì)胞3H-D-葡萄糖摻入率的變化Table 1 IncorPoration rate of3H-D-glucose in different grouPs of myocardial cells after 24，48-hour treatment（n=8，±s，nmol·mg-1·h-1）

*P＜0.05 vs control group by q test

Groups Incorporation rate of3HD-glucose after 24h Incorporation rate of3HD-glucose after 48h Control 14.07±0.27 14.06±0.43 G 13.33±0.76 13.58±0.49 Ins 12.48±0.90* 12.46±1.11*G+Ins 10.64±0.95* 10.61±1.14*

表2 干預(yù)48h后心肌細(xì)胞脂聯(lián)素mRNA和蛋白表達(dá)比較Table 2 AdiPonectin mRNA and Protein level in different grouPs of myocardial cells after 48h treatment（n=8，±s）

表2 干預(yù)48h后心肌細(xì)胞脂聯(lián)素mRNA和蛋白表達(dá)比較Table 2 AdiPonectin mRNA and Protein level in different grouPs of myocardial cells after 48h treatment（n=8，±s）

*P＜0.05 vs control group by q test

Groups Adiponectin mRNA Adiponectin protein Control 0.77±0.08 0.89±0.27 G 0.66±0.09 0.64±0.23*Ins 0.35±0.04* 0.37±0.13*G+Ins 0.38±0.04* 0.22±0.08*

2.3 直線相關(guān)分析：應(yīng)用高糖、高胰島素、高糖+高胰島素干預(yù)48h后，對照組、G組、Ins組、G+Ins組3H-D-葡萄糖摻入率與心肌細(xì)胞脂聯(lián)素mRNA表達(dá)量均呈正相關(guān)（r=0.92、0.82、0.89、0.86，P均＜0.05）。

3 討 論

胰島素抵抗是指機(jī)體對胰島素生理作用的反應(yīng)性降低或敏感性降低。產(chǎn)生胰島素抵抗的主要部位在肝臟、肌肉和脂肪組織［1］。研究［2］發(fā)現(xiàn)，約25%正常人群存在胰島素抵抗，糖耐量減低人群75%存在胰島素抵抗，2型糖尿病患者胰島素抵抗的發(fā)生率為85%左右。

研究胰島素抵抗機(jī)制以及藥物對胰島素抵抗的影響離不開胰島素抵抗細(xì)胞模型，因此建立可靠的模型極為重要。目前已成功復(fù)制出數(shù)種胰島素抵抗細(xì)胞模型，這些細(xì)胞模型主要有地塞米松誘導(dǎo)模型、高胰島素誘導(dǎo)培養(yǎng)模型、高類固醇培養(yǎng)模型、腫瘤壞死因子誘導(dǎo)模型、游離脂肪酸誘導(dǎo)模型等，其中以高胰島素培養(yǎng)模型最為穩(wěn)定、可靠，使用也最為廣泛。但這些模型細(xì)胞均為脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、肝臟細(xì)胞。目前已知與胰島素抵抗相關(guān)的最重要部位是代謝較旺盛的肝臟、骨骼肌、脂肪。心肌也是人體代謝最旺盛的器官之一。有學(xué)者［3］發(fā)現(xiàn)，胰島素受體同樣在心肌細(xì)胞表面表達(dá)，其受體數(shù)目受胰島素水平的調(diào)節(jié)。當(dāng)胰島素受體數(shù)目下調(diào)至一定程度時(shí)，則該細(xì)胞對胰島素的作用產(chǎn)生抵抗［4］。有學(xué)者［5］在研究犬體外循環(huán)心肌缺血-再灌注損傷時(shí)發(fā)現(xiàn)，在強(qiáng)應(yīng)激過程中，不僅機(jī)體全身發(fā)生了胰島素抵抗，而且作為胰島素靶組織之一的心肌也發(fā)生了胰島素抵抗。有學(xué)者［6-7］在糖尿病高血糖狀態(tài)下對心肌細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)高血糖激活了細(xì)胞多元醇代謝通路，最終導(dǎo)致肌醇代謝紊亂、細(xì)胞內(nèi)Na+-K+-ATP酶活性下降、鈣離子泵功能障礙、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)異常，引起心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能受損。但目前針對心肌細(xì)胞的胰島素抵抗研究，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。因此，胰島素抵抗心肌細(xì)胞模型的建立對研究心肌細(xì)胞局部胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。

胰島素抵抗的代表性特征是高胰島素血癥、高血糖和內(nèi)環(huán)境紊亂等［8-9］。高血糖、高胰島素血癥本身可能誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生［10］。因此，本研究采用高濃度葡萄糖、高濃度胰島素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞，排除機(jī)體全身體液、神經(jīng)調(diào)節(jié)的因素影響，進(jìn)一步探討高濃度葡萄糖、高濃度胰島素對體外心肌細(xì)胞胰島素敏感性的影響。

3H-D-葡萄糖摻入實(shí)驗(yàn)是目前較為常用的評價(jià)細(xì)胞胰島素敏感性的方法之一［11］。脂聯(lián)素被認(rèn)為是胰島素抵抗的標(biāo)記物［12］。有研究［13］表明高脂飼料喂養(yǎng)的胰島素抵抗大鼠模型內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素表達(dá)減低，羅格列酮干預(yù)后可上調(diào)脂肪組織脂聯(lián)素的表達(dá)，降低空腹胰島素水平，改善胰島素抵抗。脂聯(lián)素基因敲除的純合子小鼠可表現(xiàn)出中度的胰島素抵抗及輕度的葡萄糖耐量減低，提示脂聯(lián)素具有糾正胰島素抵抗的作用［14］。單次給予脂聯(lián)素后，高脂高蔗糖飲食小鼠血中脂肪酸和三酰甘油明顯降低、體質(zhì)量增加［15］。上述研究表明脂聯(lián)素與胰島素敏感性密切相關(guān)，脂聯(lián)素表達(dá)水平越低，胰島素抵抗越嚴(yán)重。本研究運(yùn)用高葡萄糖、高胰島素、高葡萄糖+高胰島素3種方法誘導(dǎo)心肌細(xì)胞，結(jié)果表明3組心肌細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)均下降。但高葡萄糖誘導(dǎo)法3H-D-葡萄糖摻入率與心肌細(xì)胞脂聯(lián)素mRNA表達(dá)較對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未能誘導(dǎo)出胰島素抵抗。而高胰島素誘導(dǎo)法、高葡萄糖+高胰島素法均可促使3H-D-葡萄糖摻入率顯著下降、脂聯(lián)素表達(dá)下降，促使細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗。同時(shí)，3組中3H-D-葡萄糖摻入率與心肌細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)均呈顯著正相關(guān)，進(jìn)一步證明了心肌細(xì)胞脂聯(lián)素是心肌細(xì)胞胰島素抵抗的標(biāo)志物。

胰島素抵抗不一定都伴有高血糖，高葡萄糖+高胰島素誘導(dǎo)的胰島素抵抗心肌細(xì)胞更符合高血糖伴胰島素抵抗的2型糖尿病機(jī)體的內(nèi)環(huán)境狀態(tài)，更適合作為研究2型糖尿病的心肌細(xì)胞模型。

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（本文編輯：趙麗潔）

ESTABLISHMENT AND EVALUATION OF INSULIN RESISTANCE CARDIOCYTES MODEL

WANG Mei，LI Yongjun*，LIU Suyun，ZHANG Hui，YANG Rong，MIAO Chenglong
（Department of Cardiology，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China）

ObjectiveTo establish insulin resistance cardiocytes model.MethodsCardiocytes were cultured for 24h and 48h in vitro and were divided into four groups：control group（control），glucose group（G），insulin group（Ins），glucose and insulin group（G+Ins）.The adiponectin（APN）expression in those groups was tested and the insulin sensitivity was evaluated by3H-D -glucose mixing experiment.Results3H-D-glucose mixing rate in Ins group（12.46±1.11）nmol·mg-1·h-1and G+Ins group（10.61±1.14）nmol·mg-1·h-1were all lower than control group（14.06±0.43）nmol· mg-1·h-1（P＜0.05）.APN expression in Ins group 0.35±0.04，G+Ins group 0.38±0.04，were all lower than control group 0.77±0.08 after 48h（P＜0.05）.3H-D-glucose mixing rate in four groups was positively related to APN expression（P＜0.05）.ConclusionThe insulin resistance cardiocytes model can be established by high insulin or high glucose+insulin.Insulin resistance down-regulates cardiocytes adiponectin expression.Insulin resistance is positively related to APN expression.

myocytes，cardiac；insulin；models，animal

R965.1

A

1007-3205（2012）09-0993-04

2012-03-10；

2012-06-14

河北省衛(wèi)生廳重大科技攻關(guān)項(xiàng)目（20100075）

王梅（1973-），女，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事心血管疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：lyjbs2009@yeah.net

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.09.001