過量表達魯氏酵母耐鹽基因GPD1對釀酒酵母的影響

侯麗華，于雁飛，王 川，王春玲

(食品營養與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457)

魯氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)又稱 S酵母，主要應用于醬油的高鹽稀態發酵過程中，用以改善醬油的風味[1-2]．S酵母是與模式生物釀酒酵母相近的半子囊菌酵母．魯氏酵母可在高鹽的環境中生長，比如，在醬油高鹽稀態發酵工藝的后期鹽水發酵中含鹽量高達17%，魯氏酵母依然能夠生長及發酵[3].但是在此環境中包括釀酒酵母在內的大多數酵母都不能生長．

目前，一些關于魯氏酵母的耐鹽、耐滲的基因，如 ZrPMA1、ZrSOD2、ZrSOD22、ZrGPD1、ZrHOG1和 ZrHOG2等已經被克隆和測序[4-6]．其中，GPD1即 3–磷酸甘油脫氫酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)的編碼基因，其編碼的酶可使磷酸二羥丙酮生成 3–磷酸甘油，從而增加甘油含量，在酵母耐鹽的滲透調節中發揮舉足輕重的作用[7]．因此，本文對魯氏酵母的耐鹽基因 GPD1進行研究，使其在模式酵母即釀酒酵母實驗室菌株W303中過量表達，研究其對釀酒酵母耐鹽性、甘油產量等的影響，為構建耐鹽菌株奠定理論基礎，為闡述酵母菌株的耐鹽機制提供更多的理論依據．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒和培養基

魯氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、釀酒酵母W303(Saccharomyces cerevisiae W303，MATa，leu2-3/112，ura3-1，trp1-1，his3-11/15，ade2-1，can1-100，GAL，SUC2，mal 0)、多拷貝酵母(S. cerevisiae)與大腸桿菌(E. coli)的穿梭質粒 YEplac195(Ampr，URA3)，為本實驗室保存．

YPD 培養基(g/L)：酵母浸粉 10，葡萄糖 20，蛋白胨 20，121,℃滅菌 20,min．其中，40%葡萄糖溶液115,℃滅菌20,min后，加入培養基中使含量達到2%．

CM-ura培養基(g/L)：無氨基酸的酵母氮源(YNB)6.7，腺嘌呤0.05，組氨酸0.1，色氨酸0.1，亮氨酸0.1，精氨酸0.02，天冬氨酸0.1，谷氨酸0.1，異亮氨酸0.03，賴氨酸0.03，甲硫氨酸0.02，苯丙氨酸0.05，絲氨酸0.15，蘇氨酸0.15，酪氨酸0.03，纈氨酸0.15，調節pH為6.5，加入1.5%的瓊脂，121,℃滅菌 15,min．

1.1.2 試劑與儀器

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，北京鼎國生物技術有限公司；瓊脂糖，Gene Tech(上海)有限公司；Easy Pfu DNA Polymerase、Easy Pfu 10×buffer、Ligase 10×Buffer、T4,DNA Ligase，加拿大 Fermentas生物技術公司；2.5,mmol/L dNTPs，北京全式金生物技術公司；HindⅢ內切酶、10×M Buffer、SphI 內切酶、10×H Buffer，日本東洋坊公司；腺嘌呤、組氨酸、色氨酸、亮氨酸等 15種氨基酸、無氨基酸的酵母氮源(YNB)，BBI公司．

電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫療儀器廠；飛鴿牌微量離心機，上海安亭科學儀器廠；My CyclerTM PCR 儀、DYY–6C 型水平電泳儀、凝膠成像儀，美國 Bio-Rad公司；紫外分光光度計，上海精密科學儀器有限公司．

1.2 方法

1.2.1 引物設計

根據魯氏酵母基因數據(http：//www.genolevures.org/zyro.html，序號為 ZYRO0A055390g)設計引物，GDP1-up：5′-GCGCATGCGTTGTTGTTGTC ATCACTC-3'(SphI) ；GDP1-dn ：5′-GCAAGCTTTT GTCTTTCTAATACAC-3′(HindⅢ)．GPD1 目的片段上游引物 5′端引入 SphI酶切位點(GCATGC)，下游引物 5′端引入 HindⅢ酶切位點(AAGCTT)．引物由上海生工公司合成．

1.2.2 構建質粒

提取魯氏酵母基因組，并以其為模板，以 GDP1-up和 GDP1-dn為引物作 PCR擴增(95,℃模板預變性 3,min；95,℃模板變性，55、58、60,℃引物退火1.5,min，72,℃引物延伸 2,min，共 30個循環；最后72,℃再延伸 10,min)．純化 PCR產物，并用 SphI和HindⅢ雙酶切，將酶切產物連入到同樣雙酶切的YEplac195中，得到重組質粒YEplac195-GPD1．

1.2.3 耐鹽性變化實驗

分別取 200,mL滅菌后含鹽量為 0、9%、18%的YPD 培養基各 3瓶，其中分別接種 106,mL–1的菌種2,mL．將上述樣品置于搖床中 180,r/min、30,℃培養，每隔4,h取樣測A600的值．

1.2.4 抗性實驗

將待測菌株接種到 YPD液體培養基中培養(30,℃，12,h，轉速＜200,r/min)；測 A600值，計算細胞濃度，取出約含5×106個細胞的菌液加入到1,mL新鮮培養液中活化 2,h；測 A600值，計算細胞濃度，取出約含2×106個細胞的菌液，10,000,r/min離心1,min，棄上清液；加入20,μL無菌水混勻，終濃度為1×106,μL-1．取 2,μL 加入到 18,μL 無菌水中稀釋 10倍．同樣方法按濃度遞增順序分別得到1×106、1×105、1×104、1×103、1×102,μL-1的菌液．每個稀釋度取 3,μL菌液滴在所需平板上，超凈臺晾干后，30,℃倒置培養．

1.2.5 甘油產量的測定

Cu(OH)2懸濁液的配制：取 5支試管．各注入1,mL 0.05,g/mL 的 CuSO4溶液和 3.5,mL 0.05,g/mL的NaOH溶液，振蕩，生成Cu(OH)2懸濁液．

甘油銅溶液的配制：向上述 Cu(OH)2懸濁液的試管中分別注入 6‰、7‰、8‰、9‰、10‰的甘油標準品溶液 0.5,mL，充分振蕩，即生成甘油銅溶液，離心分離，取上清液備用；以超純水為空白，630,nm 為測定波長．以 Cu(OH)2為橫坐標，630,nm 下的吸光度為縱坐標繪制標準曲線．樣品如上操作，將測得的值代入公式計算即可得出甘油產量[8]．

2 結果與討論

2.1 工程菌株的構建

將構建的質粒 YEplac195-GPD1(見圖 1)轉入大腸桿菌感受態細胞(TOP10)中，提取質粒后，用 SphI與 HindⅢ雙酶切驗證，瓊脂糖凝膠電泳檢測(見圖2)．然后將質粒 YEplac195-GPD1和空質粒 YEplac 195分別轉入釀酒酵母實驗室菌株W303中[9]，得到工程菌株WYS和對照菌株WY．

圖1 質粒YEplac195-GPD1結構示意圖Fig.1 Schematic view of the plasmid YEplac195-GPD1

圖2 重組表達質粒的SphI 和HindⅢ雙酶切鑒定Fig.2 Analysis of recombined plasmid digested by SphI and HindⅢ

2.2 耐鹽性變化

對工程菌株 WYS和對照菌株 WY在含鹽量為0、9%、18%的 YPD 培養基中的生長情況進行研究，實驗結果如圖3所示．

因為在一定濃度下，酵母細胞在 600,nm下的吸光度與細胞個數有對應關系，所以本文中通過測定不同菌株在600,nm波長下的吸光度來反映菌株的生長狀況．由圖 3可知，隨著鹽的加入，菌株 WYS和對照菌株 WY到達對數期的時間變長．這說明鹽的加入，使得細胞內外滲透壓發生變化，從而影響細胞增殖，導致到達對數期的時間延長且延緩對數期細胞的增殖．但是，在每個含鹽量下，WYS與對照菌株 WY相比，對細胞的抗滲透壓耐鹽作用仍舊可以明顯表現出來．

由上述分析可知，重組后的質粒 YEplac195-GPD1明顯比空質粒 YEplac195促進了酵母細胞的生長，不僅表現在對數生長期的提前，而且平穩期的細胞數量也有所增加，這說明基因 GPD1對于酵母細胞耐鹽性的重要作用．

圖3 菌株在不同含鹽量YPD培養基中的生長情況Fig.3 Growth of engineered strains in YPD culture media with different salt concentration

2.3 抗性變化

分別研究菌株 WYS和 WY 對 LiCl、鹽、山梨醇、乙醇和高溫的抗性，結果如圖 4所示，從左到右菌體的濃度依此為 1×106、1×105、1×104、1×103、1×102,μL-1．

由圖 4可見，在 LiCl、NaCl、乙醇不同程度刺激而產生的滲透壓力下[2]，WYS生長趨勢明顯優于WY，表現出了較好的耐性；對比圖 4(a)和圖 4(e)發現，(a)組菌落比(e)組菌落大而圓，這說明隨著鹽的加入，導致了細胞內水分的外流，細胞發生了質壁分離現象．而1,mol/L的山梨醇濃度對于該系列菌株來說并無太大影響．42,℃培養對兩株菌株的影響基本相同，只有最高濃度才能生長，但是 WYS的生長優于WY，表明過量表達GPD1對細胞耐受熱具有明顯的作用．

圖4 工程菌株的抗性比較Fig.4 Tolerance comparison of engineered strains

2.4 甘油產量變化

按照 1.2.5方法得到標準曲線 y＝0.044,3x＋0.001,3，R2＝0.999,6．將工程菌株WYS和WY 分別培養在含鹽量為0、9%、18%的YPD培養基中，30,℃培養．當培養至對數后期，測定細胞內外甘油產量，如圖5所示．

圖5 甘油產量變化Fig.5 Changes of glycerol content

由圖 5可知，隨著含鹽量的增加，WYS和 WY菌株的甘油產量都依次增加，但增加的程度并不一致，這表明它們對環境的應答并不完全一樣．對于同一菌株，隨著含鹽量的增加，其甘油產量也隨之增加；對于同一個含鹽量，WYS菌株的甘油產量高于WY，結合圖 4(e)結果，這說明 WYS中過量表達GPD1使其更能適應外界滲透壓的變化．

3 結 語

基因 GPD1只是耐鹽通路中的一個小分支，要進一步闡明酵母菌株的耐鹽機制，將需要研究此通路中的其他關鍵基因，如FPS1(編碼甘油由胞內向胞外滲透的通道蛋白)、PMA1(編碼質膜 H+-ATPase)、PDC1(編碼丙酮酸脫羧酶)、ALD6(編碼胞質乙醛脫氫酶)等．還需建立起一個立足點較多的基因功能網絡，結合酵母的代謝網絡，對醬油添加酵母的耐鹽機制進行研究．此外，在本研究中只是對過量表達魯氏酵母耐鹽基因 GPD1對釀酒酵母 W303的影響進行了分析，并沒有研究自身過表達 GPD1對耐鹽家族成員魯氏酵母的影響．因此在后續的研究中可以利用質粒 pZEU[10]在魯氏酵母△ura3缺陷型菌株中過量表達耐鹽基因GPD1．

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