枯草芽孢桿菌工程菌產耐酸性高溫α-淀粉酶發酵條件的優化

胡 博，劉逸寒，徐艷靜，薄嘉鑫，路福平

(工業發酵微生物教育部重點實驗室；天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

α-淀粉酶作為淀粉酶的一種，是目前最重要、最古老、應用范圍最廣的工業酶制劑之一，其中耐高溫α-淀粉酶憑借其熱穩定上的優勢已經占據了很大的市場[1]．耐高溫α-淀粉酶目前被廣泛地應用于味精、啤酒、有機酸、酒精等食品發酵以及淀粉工業[2-3]．目前，國內外市場中常用的耐高溫α–淀粉酶的最適 pH范圍為 6～7[4]，在酸性條件下酶活明顯降低，甚至失去活性，已經不能滿足酸性條件下淀粉原料深加工工藝的要求，因此對耐酸性α-淀粉酶的需求日益上升．近幾年來國內開展了大量的針對產耐酸性α-淀粉酶菌株發酵條件優化的研究，王淑軍等[5]對 1株產耐熱酸性α-淀粉酶的超嗜熱古菌進行了發酵條件的優化，經優化后α-淀粉酶活力達到了 500,U/mg；劉雅琴等[6]在篩選出的耐酸性α-淀粉酶產生菌的基礎上對其進行發酵培養基與發酵條件的優化，最終α-淀粉酶活力達到 31.4,U/mL，比初始時提高了 0.65倍；莫新迎等[7]通過單因素實驗和響應面分析法對 1株產耐酸性α-淀粉酶的小孢根霉菌培養基組分進行優化，α-淀粉酶活力較優化前提高了 0.15倍，達到259.902,U/g干物質，但其酶活力均不高．

本實驗通過對本課題組前期研究獲得的可高效表達耐酸性高溫α-淀粉酶枯草芽孢桿菌工程菌株pWB-amyd/WB600[8-10]發酵條件進行優化，旨在提高耐酸性高溫α-淀粉酶活力，為以淀粉為原料的深加工工業的發展提供有力支撐．

1 材料與方法

1.1 菌株

產耐酸性高溫α-淀粉酶工程菌株 pWB-amyd/WB600，由本實驗室構建[9]并保藏．以初始發酵培養基及未優化的發酵條件進行發酵培養，初始酶活力為1,890,U/mL．

1.2 培養基

斜面培養基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母浸出粉 5，NaCl 10，瓊脂粉 20，卡那霉素 0.03，pH 自然．

種子培養基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母浸出粉 5，NaCl 10，卡那霉素 0.03，pH 自然．

初始發酵培養基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母浸出粉 5，NaCl 10，pH 自然．

1.3 培養方法

種子的培養：取凍存于–70,℃的工程菌株 pWB-amyd/WB600，將其接種到新鮮斜面培養基，37,℃培養 18,h后，挑取單菌落接入種子培養基，37,℃、200,r/min搖床培養16,h，得到種子液．

初始發酵培養：以 1%接種量接種至裝液量50,mL發酵培養基的 250,mL三角瓶中，在 37,℃、160,r/min培養36,h．

1.4 生長曲線的繪制

配制 400,mL發酵培養基分裝至 250,mL三角瓶，編號為 1—8，每瓶裝液量 50,mL，121,℃滅菌20,min，待用．從新鮮斜面培養基挑取單菌落接入含有發酵培養基的三角瓶中，于 37,℃、200,r/min搖床振蕩培養．每隔一定時間取樣．將菌液適當稀釋至吸光度在0.1～1.0范圍內，用分光光度計于光程1,cm、波長 600,nm條件下測定其吸光度．以時間為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制重組菌生長曲線．

1.5 發酵培養基優化

1.5.1 碳源的選擇

選擇 10,g/L的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精、玉米粉、薯干粉作為碳源，氮源為10,g/L的蛋白胨，比較不同碳源對產酶的影響，確定最適碳源．再以10,g/L的蛋白胨為氮源，加入10、20、30、40、50,g/L的最適碳源，確定最適碳源的最優質量濃度．

1.5.2 氮源的選擇

以最適質量濃度的最適碳源為培養基基本組分，分別加入 10,g/L的胰蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、NH4NO3、NH4Cl，比較不同氮源對產酶的影響，確定最適氮源．再以最適質量濃度的最適碳源為培養基基本組分，加入 10、20、30、40、50,g/L 的最適氮源，確定最適氮源的最優質量濃度．

1.5.3 金屬離子Ca2+對產酶的影響

以最優質量濃度的最適碳源、氮源為培養基基本組分，加入 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0,g/L 的 Ca2+進行發酵，確定Ca2+的最優質量濃度．

1.5.4 Na2HPO4對產酶的影響

以最優濃度的最適碳源、氮源、Ca2+為培養基基本組分，加入 0、4、8、12、16,g/L 的 Na2HPO4進行發酵，確定Na2HPO4的最優質量濃度．

1.5.5 正交實驗

利用 L9(34)正交實驗篩選出玉米粉、蛋白胨、CaCl2和Na2HPO4的最佳配比．

1.6 發酵條件優化

1.6.1 培養基初始pH對產酶的影響

以上述優化后的培養基配方為基礎，用一定濃度的 NaOH或 HCl溶液調節培養基初始 pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 進行發酵，確定培養基最適初始pH．

1.6.2 接種量對產酶的影響

以原始發酵培養條件為基礎，分別按 1%、2%、3%、4%和 5%的接種量接種到優化后的最優培養基中，在 37,℃、160,r/min培養 36,h，取樣測定酶活力，確定最適接種量．

1.6.3 裝液量對產酶的影響

按優化后所得的最適接種量將種子液分別接種于裝有 20、30、40、50、60、70,mL 發酵培養基的250,mL三角瓶中，在 37,℃、160,r/min培養 36,h，取樣測定酶活力，確定最適裝液量．

1.6.4 搖床轉速對產酶的影響

將種子液接種到發酵培養基中，接種量和裝液量均按照優化后的結果，在 37,℃條件下，搖床轉速分別為 120、160、200、240,r/min 培養 36,h，取樣測定酶活力，確定最適搖床轉速．

1.6.5 發酵溫度對產酶的影響

將種子液接種到發酵培養基中，接種量、裝液量及搖床轉速均按照優化后的結果，在27、32、37、42,℃分別培養36,h，取樣測定酶活力，確定最適發酵溫度．

1.7 酶活檢測

參照QB/T 2306—1997[11]．酶活力單位定義：在70,℃、pH 6.0條件下，1,min液化1,mg可溶性淀粉成為糊精所需要的酶量，即為 1個酶活力單位，以U/mL表示．

式中：X，樣品的酶活力(U/mL)；c，測試的酶液濃度(U/mL)；n，樣品的稀釋倍數；16.67，換算常數．

2 結果與分析

2.1 生長曲線的測定

工程菌株pWB-amyd/WB600生長曲線如圖1所示．由圖 1可知，0～12,h為生長的延滯期；12～18,h為對數生長期；從18,h開始進入穩定期．由于在對數生長中后期，菌體量較大，此時菌體還未發生自溶，因此確定在接種后18,h時收集菌體．

圖1 工程菌株pWB-amyd/WB600生長曲線Fig.1 Growth curve of pWB-amyd/WB600

2.2 發酵培養基的優化

2.2.1 碳源對產酶的影響

初始發酵培養基中無特定的碳源，胰蛋白胨和酵母提取物僅能維持菌體生長至A600為3.0左右[12]，為了考察重組菌株對碳源的利用情況，本實驗選擇了幾種常用的碳源進行碳源的優化．由表 1結果可知，玉米粉是產酶的最佳碳源，耐酸性高溫α-淀粉酶活力達到最高值，為 2,090,U/mL，其余依次為可溶性淀粉、糊精、薯干粉、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖．玉米粉的最優質量濃度實驗結果表明，隨著玉米粉質量濃度的增加，耐酸性高溫α-淀粉酶活力也隨之增加，當玉米粉質量濃度為 20,g/L時，耐酸性高溫α-淀粉酶活力達到最高，為 2,310,U/mL．當繼續加大玉米粉質量濃度時，其耐酸性高溫α-淀粉酶活力不再隨玉米粉質量濃度的增加而增加，反而隨之下降，所以本實驗選取20,g/L為玉米粉的最適質量濃度．

表1 碳源對產酶的影響Tab.1 Effects of carbon resource on the yield of enzyme

2.2.2 氮源對產酶的影響

為了考察重組菌株對碳源的利用情況，實驗中同時對有機氮源和無機氮源進行研究，選擇 10,g/L的胰蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米漿、尿素、NH4NO3、NH4Cl作為氮源，碳源為20,g/L的玉米粉，其他條件相同，結果見表2．

表2 氮源對產酶的影響Tab.2 Effects of nitrogen resource on the yield of enzyme

由表 2可知，重組菌株利用以上氮源培養時，有機氮源對產酶的促進作用明顯優于無機氮源．單一的無機氮源作為培養基中的氮源，菌體生長緩慢，產酶量較低．而有機氮源中，蛋白胨是最佳的氮源，其主要成分是各種氨基酸、肽類等可溶性氮化合物，耐酸性高溫α-淀粉酶活力達到最高值，為2,310,U/mL．蛋白胨最優濃度實驗結果表明，隨著蛋白胨濃度的增加，耐酸性高溫α-淀粉酶活力也隨之增加，當蛋白胨質量濃度為 30,g/L時，耐酸性高溫α-淀粉酶活力達到最高，為2,620,U/mL．所以本實驗選取30,g/L為蛋白胨最適質量濃度．

2.2.3 金屬離子Ca2+質量濃度對產酶的影響

根據 Machius等[13]的研究可知，Ca2+的添加對產地衣芽孢桿菌α-淀粉酶有明顯的促進作用，這是因為產地衣芽孢桿菌α-淀粉酶是一種金屬酶，金屬離子Ca2+與之結合，有利于保持α-淀粉酶的結構穩定性及其活力．故選用不同質量濃度的 Ca2+進行發酵，由圖2中可以看出，隨著Ca2+質量濃度的增加，耐酸性高溫α-淀粉酶活力也隨之增加，當 Ca2+質量濃度為 0.6,g/L時，耐酸性高溫α-淀粉酶活力達到最高，為2,740,U/ mL．當繼續加大Ca2+質量濃度時，其耐酸性高溫α-淀粉酶活力不再隨Ca2+質量濃度的增加而增加，反而隨之下降，所以本實驗選取0.6,g/L為Ca2+最適質量濃度．

圖2 CaCl2質量濃度對產酶的影響Fig.2 Effects of CaCl2concentration on the yield of enzyme

2.2.4 磷酸鹽質量濃度對產酶的影響

磷酸鹽對微生物產酶的作用是非常重要的，磷是細胞合成核酸必需的一種元素，也是加快吸收葡萄糖，促進細胞生長不可或缺的一種物質．所以耐酸性高溫α-淀粉酶活力隨著磷酸鹽質量濃度的增加而增加，當磷酸鹽濃度為8,g/L時，耐酸性高溫α-淀粉酶活力達到最高，為 2,870,U/mL．但是隨著磷酸鹽質量濃度的繼續升高，耐酸性高溫α-淀粉酶活力卻隨之下降，所以本實驗選取 8,g/L為磷酸鹽最適質量濃度(圖 3)．

圖3 磷酸鹽質量濃度對產酶的影響Fig.3 Effects of Na2HPO4 concentration on the yield of enzyme

2.2.5 正交實驗

利用 L9(34)正交實驗篩選出玉米粉、蛋白胨、CaCl2和Na2HPO4的最佳配比，結果見表3．

表3 培養基配方正交實驗結果及其極差分析Tab.3 Results and variance analysis of orthogonal experiment of medium components

由表 3可知，在玉米粉、蛋白胨、CaCl2和Na2HPO4這4種培養基組分的不同配比中，耐酸性高溫α-淀粉酶活力最高的組合為(g/L)：玉米粉 20，蛋白胨 30，CaCl20.5，Na2HPO48．極差分析結果表明4個因素的影響程度依次為：玉米粉＞蛋白胨＞Na2HPO4＞CaCl2．

由于從理論上優化得到的培養基不在正交實驗表中，經驗證實驗結果表明，耐酸性高溫α-淀粉酶活力達到 3,280,U/mL，此活力大于正交實驗中出現的所有結果，驗證了選取該結果的正確性．因此，確定最適發酵培養基配方為(g/L)：玉米粉 20，蛋白胨30，CaCl20.5，Na2HPO48．

2.3 發酵條件

2.3.1 培養基初始pH對產酶的影響

pH是影響微生物正常生理活動的一個重要因素．由圖4結果顯示，發酵培養基初始pH在5.0～8.0之間，都可產生耐酸性高溫α-淀粉酶，初始pH為6.5時，即發酵培養基自然 pH，耐酸性高溫α-淀粉酶活力最高，達到3,280,U/mL．所以本實驗選取pH,6.5為最適初始pH．

圖4 初始pH對產酶的影響Fig.4 Effects of pH on the yeild of enzyme

2.3.2 接種量對產酶的影響

由圖 5結果顯示，在接種量為 1%時，由于菌體數量過低，減少了蛋白質分泌總量，因此酶活力較低．當以 2%的接種量進行發酵培養時，菌體蛋白分泌較高，酶活力顯著提高，耐酸性高溫α-淀粉酶活力最高，達到 3,450,U/mL．隨著接種量繼續增加，耐酸性高溫α-淀粉酶活力卻隨之下降．根據余曉紅等[14]的研究可知，這是由于培養基中菌體相對密度增大，導致菌體生長時所需培養基成分不足同時溶氧不足，菌體生長狀態不良，反而使酶活力降低造成的，所以本實驗選取2%為最適接種量．

圖5 接種量對產酶的影響Fig.5 Effects of inoculation volume on the yield of enzyme

2.3.3 裝液量對產酶的影響

在微生物發酵過程中，能夠提供充足的氧分對于提高產酶量具有重要的作用，在一定范圍內，裝液量越低，產酶量越高．由圖 6結果顯示，裝液量在30,mL以上時，隨著裝液量的增加，發酵過程中溶氧量不足，菌體生長受到抑制，導致耐酸性高溫α-淀粉酶活力下降．當裝液量為30,mL時，耐酸性高溫α-淀粉酶活力達到最高，為 3,670,U/mL．裝液量為 20,mL時，雖然溶解氧量充足，但是由于養分不足，菌體生長緩慢，導致耐酸性高溫α-淀粉酶活力下降．所以本實驗選取30,mL/250,mL為最適裝液量．

圖6 裝液量對產酶的影響Fig.6 Effects of medium volume on the yield of enzyme

2.3.4 搖床轉速對產酶的影響

搖床轉速同樣影響發酵液中氧氣的溶解量．由表 4結果顯示，當搖床轉速較低時，發酵液中氧氣的溶解量不足，不利于菌體生長，導致耐酸性高溫α-淀粉酶活力下降，因而耐酸性高溫α-淀粉酶活力隨著轉速的升高而變高，當達到200,r/min時，耐酸性高溫α-淀粉酶活力達到最高，為3,980,U/mL．隨著搖床轉速的繼續升高，耐酸性高溫α-淀粉酶活力卻隨之降低，所以本實驗選取200,r/min為最適搖床轉速．

表4 轉速對產酶的影響Tab.4 Effects of rotation speed on the yield of enzyme

2.3.5 溫度對產酶的影響

培養溫度對菌株產酶的影響結果見表5．

表5 培養溫度對產酶的影響Tab.5 Effects of cultivated temperature on enzyme production

由表 5結果顯示，低溫不利于菌株生長產酶，隨著溫度升高，反應速度加大，生長代謝加快，生產期提前，菌株的產酶量大幅度提高，當溫度到達 37,℃時，菌體的生長最旺盛，菌株的產酶活力大幅度增加，耐酸性高溫α-淀粉酶活力達到最高，為 3,980,U/mL．但是隨著溫度的繼續升高使得菌體易于衰老，發酵周期縮短，導致產物的最終產量降低．所以本實驗選取37,℃作為最適發酵溫度．

3 結 論

枯草芽孢桿菌工程菌株 pWB-amyd/WB600，具有高拷貝的重組表達質粒，且具有良好地遺傳穩定性，可高效表達耐酸性高溫α-淀粉酶．本研究在此基礎上，對該工程菌株進行發酵培養基及發酵條件的優化．分別研究碳源、氮源、金屬離子以及磷酸鹽對耐酸性高溫α-淀粉酶活力的影響，通過正交實驗進一步分析，確定最適發酵培養基為(g/L)：玉米粉 20，蛋白胨 30，CaCl20.5，Na2HPO48．同時，確定了搖瓶最佳發酵工藝：將重組菌的單菌落接種于種子培養基(50,mL/250,mL三角瓶)中，于 37,℃、200,r/min條件下培養18,h后，以2%接種量接種于優化后的發酵培養基(30,mL/250,mL 三角瓶)中，初始 pH 6.5，37,℃、200,r/min培養 36,h后，最終得到的耐酸性高溫α-淀粉酶活力為3,980,U/mL，是優化前活力的2.1倍．

［1］ 胡建恩，曹茜，楊帆，等. 耐高溫α-淀粉酶高密度高表達發酵條件的優化[J]. 食品科學，2012，33(1)：219-225.

［2］ 張強，黃丹，王川. 耐高溫α-淀粉酶產生菌的選育研究[J]. 中國釀造，2008(7)：21-23.

［3］ Haki G D，Rakshit S K. Developments in industrially important thermostable enzymes：A review[J]. Bioresour Technol，2003，89(1)：17-34.

［4］ 劉逸寒，李玉，路福平，等. 耐酸性高溫α-淀粉酶突變基因在大腸桿菌中的表達及酶學性質研究[J]. 食品與發酵工業，2007，33(2)：36-41.

［5］ 王淑軍，陸兆新，秦松，等. 超嗜熱古菌耐熱酸性α-淀粉酶的發酵條件和酶學性質研究[J]. 海洋與湖沼，2009，40(1)：19-26.

［6］ 劉雅琴，烏日娜，段金華. 耐酸性α-淀粉酶產生菌的發酵條件優化[J]. 安徽農業科學，2010，38(35)：19888-19890.

［7］ 莫新迎，高梅瑩，韓丹，等. 耐酸性α-淀粉酶產生菌篩選及培養基優化[J]. 中國釀造，2010(4)：85-88.

［8］ 劉逸寒，李玉，田琳，等. 耐酸性高溫α?淀粉酶突變基因的異源表達及純化[J]. 化學與生物工程，2007，24(3)：58-62.

［9］ Liu Yihan，Lu Fuping，Li Yu，et al. Characterisation of mutagenised acid-resistant alpha-amylase expressed in Bacillus subtilis WB600[J]. Applied Microbiology Biotechnology，2008，78：85–94.

［10］Liu Yihan，Lu Fuping，Li Yu，et al. Acid stabilization of Bacillus licheniformis alpha amylase through introduction of mutations[J]. Applied Microbiology Biotechnology，2008，80：795–803.

［11］中國輕工總會. QB/T 2036–1997 耐高溫α-淀粉酶制劑[S]. 北京：中國輕工業出版社，1998.

［12］黃鶴，楊晟，李仁寶，等. 重組青霉素 G 酰化酶在枯草芽孢桿菌中的表達條件優化[J]. 中國生物化學與分子生物學報，2001，17(2)：173–177.

［13］Machius M，Declerck N，Huber R，et al. Kinetic stabilization of Bacillus licheniformis α-amylase through introduction of hydrophobic residues at the surface[J]. J Biol Chem，2003，278(13)：11546–11553.

［14］余曉紅，汪志君，方維明. 麥汁中啤酒酵母的最適接種量研究[J]. 釀酒科技，2003(4)：73-74.