SPA的高效表達(dá)及其親和介質(zhì)制備條件的優(yōu)化

金衛(wèi)華,張三燕

(1.武漢東湖學(xué)院，湖北 武漢 430212；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué),江西 南昌 330045)

金黃色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal protein A，SPA)是大多數(shù)金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁抗原的主要成分，約占細(xì)胞壁蛋白的6.7%，能與多數(shù)哺乳動物的IgG的Fc段和少量IgM、IgA結(jié)合，但對不同種屬IgG的親和能力不同[1]。SPA與IgG的結(jié)合部位是CH2和CH3的交界處，結(jié)合后不影響免疫球蛋白的免疫學(xué)活性[2]，因此，可以將SPA與Sepharose 4B偶聯(lián)制備高效的免疫球蛋白純化柱；SPA用酶、熒光素、膠體金等標(biāo)記可制備間接二抗，具有很高的實(shí)用價值[3]。

作者在此采用原核表達(dá)技術(shù)，對SPA的誘導(dǎo)表達(dá)條件及親和介質(zhì)制備條件進(jìn)行了優(yōu)化，擬為其產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗

1.1 材料、試劑與儀器

金黃色葡萄球菌CowanI6538標(biāo)準(zhǔn)株、大腸桿菌BL21(DE3)，武漢大學(xué)；pET32a(+)載體，TaKaRa 公司；Pfu酶、T4連接酶、EcoRI、XhoI內(nèi)切酶、dNTPmix，MBI公司；引物，上海生物工程技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，Omega公司；IPTG，Sigma公司；兔IgG-HRP，Santa cruz；鎳柱，Invitrogen公司；其余試劑均為國產(chǎn)。實(shí)驗所用儀器均為國產(chǎn)。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基，常規(guī)配制滅菌。5×M9鹽溶液(NaH2PO4·12H2O 17.1 g、KH2PO43.0 g、NaCl 0.5 g、NH4Cl 1.0 g定容至200 mL)；M9培養(yǎng)基：在滅過菌的200 mL 5×M9鹽溶液中加入已過濾除菌的2 mL 1 mol·L-1的MgSO4、0.1 mL 1 mol·L-1的CaCl2、20 mL 20%的葡萄糖，用滅菌蒸餾水定容至1000 mL。

1.3 方法

1.3.1 SPA基因的克隆及重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-SPA的構(gòu)建

參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。

1.3.2 SPA的誘導(dǎo)表達(dá)

在含100 μg·mL-1Amp(氨芐青霉素)的LB固體培養(yǎng)基中劃線接種大腸桿菌BL21[含重組質(zhì)粒pET32a(+)-SPA]，于37 ℃培養(yǎng)過夜；挑取單菌落，于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)至A600值為0.7左右；再按5%的接種量接種于100 mL含Amp的M9培養(yǎng)基中，于37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h至A600值為0.7；取出培養(yǎng)瓶均勻冰浴5 min后取1 mL菌液，于10 000 r·min-1離心5 min，去上清，置-80 ℃冰箱保存；將其余培養(yǎng)液置低溫(15 ℃)搖床于150 r·min-1振蕩培養(yǎng)45 min后，加入IPTG(終濃度為0.8 mmol·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)，分別在第1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d后各取樣1 mL，離心，去上清，置-80 ℃冰箱保存。

1.3.3 SPA表達(dá)量的檢測及Western blotting鑒定

用SDS-PAGE對各個時期的重組菌取樣進(jìn)行SPA表達(dá)量的基本檢測；用辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔IgG鑒定表達(dá)的SPA。

1.3.4 SPA的純化

取表達(dá)量最大時期的菌液100 mL，于4 ℃、6000 r·min-1離心20 min，收集菌體，取沉淀，用4 mL平衡緩沖溶液(Lys緩沖溶液，含5 mmol·L-1NaH2PO4和30 mmol·L-1NaCl，pH值8.0)重懸細(xì)胞，加0.15 g·mL-1溶菌酶(終濃度為0.8 mg·mL-1)后于-20 ℃過夜，加適量DNase，混勻后于37 ℃振蕩3 min，然后滴加30～40 mL Lys緩沖溶液并于37 ℃振蕩20 min，直至菌液變?yōu)檩^澄清無粘稠狀，再于4 ℃、8000 r·min-1離心20 min，取上清液；將上清液與20 mL預(yù)先用Lys緩沖溶液平衡的His鎳柱混合放在錐形瓶中4 ℃振蕩過夜，將樣品上柱，并用Lys緩沖溶液平衡至A為0.02～0.05；用20 mmol·L-1咪唑洗脫緩沖溶液(含20 mmol·L-1咪唑、5 mmol·L-1NaH2PO4和30 mmol·L-1NaCl，pH值8.0)洗去雜蛋白，再用200 mmol·L-1咪唑溶液洗脫，收集吸收高峰期的洗脫液，測A280后真空冷凍干燥，稱重，保存。

1.3.5 Sepharose 4B偶聯(lián)SPA

取50 mL Sepharose 4B和50 mg SPA平均分為10等份，分別在偶聯(lián)液(含100 mmol·L-1NaHCO3和150 mmol·L-1NaCl)中透析過夜平衡。

將5 mL沉降體積的Sepharose 4B于布氏漏斗中用蒸餾水洗2次，抽干后轉(zhuǎn)入50 mL帶磨口的三角瓶內(nèi)，加入預(yù)冷的堿性PBS 3 mL和冷蒸餾水2 mL，混勻，置冰盒中；攪拌下滴加10%的CNBr，2 min內(nèi)加完，繼續(xù)攪拌8 min；迅速傾入布氏漏斗并抽干，大量水洗后再加20 BV預(yù)冷的偶聯(lián)液洗滌，抽干后即為活化的Sepharose 4B。

將活化的Sepharose 4B立即轉(zhuǎn)入已平衡好的SPA溶液中，混勻，于4 ℃緩慢攪拌6～20 h，每個等份的偶聯(lián)時間分別為6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h。

將偶聯(lián)好的Sepharose 4B-SPA復(fù)合物裝柱；用PBS洗柱至0.5A=0.05左右，紫外檢測洗脫液A280。A280×洗脫液的總體積即為未偶聯(lián)蛋白的含量，由此計算偶聯(lián)率。

用2 BV 1.0 mol·L-1乙醇胺洗滌后封柱2 h；依次用2 BV pH值4.0的0.1 mol·L-1NaAc-NaCl、0.5 mol·L-1NaCl、2 BV pH值8.0的0.1 mol·L-1H3BO3-Na2B4O7、0.5 mol·L-1NaCl、2 BV pH值2.3的0.1 mol·L-1Gly-HCl緩沖溶液洗柱；最后用PBS洗至中性，加入0.3% NaN3，于4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 Sepharose 4B-SPA復(fù)合物純化免疫球蛋白

取經(jīng)弗氏完全佐劑免疫的家兔血100 mL于4 ℃、12 000 r·min-1離心，將離心后的血漿分為8等份，每份5 mL，用生理鹽水稀釋5倍后加入到不同偶聯(lián)率的Sepharose 4B-SPA層析柱中；用生理鹽水洗脫未吸附的蛋白，流速15 mL·h-1，直至A280<0.02；用pH值2.7的HCl-Gly緩沖溶液洗脫IgG，收集的洗脫液50 mL用1 mol·L-1的NaHCO3溶液中和至pH值為7.0，置-20 ℃保存；紫外檢測洗脫液的蛋白含量，SDS-PAGE檢測純化效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 SPA在不同時間的表達(dá)量(圖1)

1.低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn) 2.37 ℃培養(yǎng)4 h的重組菌 3～9.IPTG誘導(dǎo)第1～7 d的BL21重組菌 10.純化的SPA

由圖1可知，IPTG誘導(dǎo)第1～4 d，SPA的表達(dá)量逐漸增加；隨著誘導(dǎo)時間的繼續(xù)延長，表達(dá)量反而有所減少。

2.2 SPA的Western blotting鑒定結(jié)果(圖2)

2、3.低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn) 1、4.初步純化的SPA

由圖2可知，43.0 kDa附近明顯有SPA表達(dá)。

2.3 SPA與Sepharose 4B不同偶聯(lián)率及對IgG的吸附能力(表1)

表1 不同偶聯(lián)時間的偶聯(lián)率及對IgG的吸附能力

由表1可知，偶聯(lián)時間不同，SPA的偶聯(lián)率也不同；不同偶聯(lián)率的Sepharose 4B-SPA對IgG的吸附能力也不一樣，并不是偶聯(lián)率越高，親和層析介質(zhì)的容量越大，對IgG的純化效果就越好，這可能和SPA與IgG結(jié)合時的空間構(gòu)象有關(guān)。偶聯(lián)時間為14 h時，SPA偶聯(lián)率為89.67%，對IgG的純化效果最好。

2.4 Sepharose 4B-SPA復(fù)合物對IgG的純化效果(圖3)

1.低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn) 2.純化后兔IgG

由圖3可知，純化后兔IgG的純度是相當(dāng)高的。

2.5 討論

雖已有SPA誘導(dǎo)表達(dá)的相關(guān)報道[4～6]，但通常是在37 ℃短時間內(nèi)完成的，尚未有低溫、長時間誘導(dǎo)和具體表達(dá)量的報道。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，在43.0 kDa附近明顯有SPA表達(dá)， 證明低溫、 長時間誘導(dǎo)的方法是可行的。其原理是：15 ℃時，細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的活性降低，對SPA的降解減少。目前報道使用的培養(yǎng)基一般是LB或DMEM培養(yǎng)基，而本實(shí)驗所用M9培養(yǎng)基的基本成分是鹽，能維持大腸桿菌的基本生存需要，但不會使其過快生長而迅速死亡，這也是能長時間誘導(dǎo)的原因之一。研究中發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)1～4 d內(nèi)SPA的表達(dá)量逐漸增加，第4 d的表達(dá)量達(dá)到25 mg·(L菌液)-1，但是隨著誘導(dǎo)時間的繼續(xù)延長，SPA的表達(dá)量有所下降，可能與低溫下細(xì)胞分裂減少、數(shù)量下降及蛋白酶的緩慢降解有關(guān)。

3 結(jié)論

使用M9培養(yǎng)基，以大腸桿菌BL21為宿主菌、pET32a(+)為載體，在15 ℃、IPTG濃度為0.8 mmol·L-1、150 r·min-1、誘導(dǎo)時間為4 d的條件下，SPA能夠得到高效表達(dá)；在SPA∶Sepharose 4B=1∶1(質(zhì)量體積比)、偶聯(lián)時間為14 h時，SPA偶聯(lián)率為89.67%，對IgG的純化效果最好。

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