薄層等電聚焦-X-射線熒光光譜法測定鐵超載小鼠肝中鐵含量分布

張 燕，劉家琴，高中洪

(1.西華大學物理與化學學院,四川 成都 610039；2.華中科技大學化學與化工學院，湖北 武漢 430074)

鐵是人體必需的微量元素之一，對維持人體正常機能起著十分重要的作用[1，2]。但是長期以來，人們只注意到鐵營養價值的一面，而忽略了鐵過量的潛在危害。鐵超載(Iron overload)，或者稱為鐵負荷，是指由于遺傳因素或病理條件下鐵攝入過多，導致機體出現一系列病理變化，特別是肝、腎損傷。鐵超載常見于過度輸血、血紅蛋白合成障礙、膳食結構改變等，特別是后者逐漸受到許多學者的重視。人可因大量食用鐵強化食品或紅肉(血紅素鐵)、超量服用維生素C或某些含鐵多的藥物(尤其是補藥)、使用鐵制炊具、長期飲酒(紅酒中含鐵較多)等，導致體內鐵超載[3]。研究發現，過多的鐵會損傷細胞，引發遺傳血色病[4，5]、神經退行性疾病[6]、心血管疾病[7]及糖尿病等[8,9]。

薄層等電聚焦(Thin-layer isoelectric focusing)是一種高分辨率的蛋白質分離技術，其基本原理是利用蛋白質等電點的不同，在一個穩定的、連續的、線性的pH值梯度中進行蛋白的分離分析[10]。X-射線熒光光譜法(X-Ray fluorescence spectrometry，XRF)是常用的非破壞性元素定性和定量分析技術，分析范圍廣、操作便捷，可用來測量性質差別很大的樣品，不受元素價態以及試樣形狀和大小限制，且不要求或只要求做極少量樣品準備工作。如Sz?kefalvi-Nagy等[11,12]用電泳分離鐵-硫蛋白及含Fe、Ni的氫化酶后，采用質子激光X-射線熒光法直接測定蛋白條帶中Fe、Ni的含量。高愈希等[13]采用電泳和同步X-射線熒光法分析了人肝細胞胞質溶液中金屬蛋白的分布。陳春英等[14,15]也采用同樣的方法分析了金屬硫蛋白在不同組織中的分布。

鐵超載后，鐵在肝中大量聚積[16]。因肝中各個亞細胞器結構和功能的不同，可以推測鐵超載后各亞細胞器中鐵含量的增加將有所差異。目前，關于鐵超載后蛋白鐵在體內主要臟器中的分布和定位方面的研究還很少報道。

作者在此采用薄層等電聚焦和X-射線熒光光譜法分析鐵超載后，小鼠肝中各個亞細胞器中鐵含量的分布，以進一步探究鐵超載導致機體損傷的機理。

1 實驗

1.1 動物分組、飼養及處理

昆明種小鼠，清潔級，體重(20.6±0.5) g左右，雄性，購自湖北省衛生防疫站。小鼠隨機分為2組，每組4只，分別為陰性對照組和陽性對照組。2組均給以正常飼料，正常飲水。陽性對照組隔1 d按100 mg·(kg bw)-1腹腔注射濃度為20 mg·mL-1的右旋糖苷鐵，共注射5次，右旋糖苷鐵總注射量為500 mg·(kg bw)-1；而陰性對照組則注射同量的生理鹽水。最后一次注射完后再喂養(室溫、正常光照及飲水)45 d后，于第46 d用戊巴比妥酸麻醉后迅速取出小鼠肝臟(處理前一晚禁食，正常飲水)，在冰冷的生理鹽水中洗凈余血，臟器用濾紙吸干，稱重。稱取部分組織，剪碎，然后和冰冷的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4，4 ℃)按1∶9的比例制成10%的組織勻漿。

1.2 肝胞液、線粒體、微粒體的制備

取10%的組織勻漿，用低溫低速離心機以1000～2000 r·min-1離心10 min，棄沉淀；上清液在低溫高速離心機上以8000～10 000 r·min-1離心15 min，上清液即為肝胞液；沉淀用磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，反復離心后沉淀即為線粒體；取肝胞液在低溫高速離心機上以105 000×g離心1 h，沉淀用磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，重復離心后沉淀即為微粒體。

1.3 薄層等電聚焦分析

115 mm×85 mm×0.5 mm的5%聚丙烯酰胺凝膠(內含5%的甘油以及2.4%的載體兩性電解質，pH=3.0～9.5)。上樣量20 μL，且上樣靠近正極端。聚焦采用分步升壓方式：100 V，30 min；200 V，60 min；280 V，60 min。用表面電極測定凝膠沿電泳方向的pH值梯度分布。在凝膠上覆蓋一層玻璃紙，置潔凈干燥通風處干燥。

1.4 X-射線熒光光譜分析

在中國科學院高能物理所核分析室的PW1830型X-光機上進行。陽極電壓30 kV，電流強度40 mA，為鉬陽極靶。為了忽略樣品對入射X-射線吸收的影響，在X-光管出口處放置一定厚度的鋁箔以吸收低能X-射線。干膠板固定在樣品移動臺上，選好位置后用1 cm×0.5 cm的光斑照射樣品。發出的X-射線由垂直于入射方向Si(Li)探測器探測，信號經Ortec X-射線熒光光譜儀獲取輸出。沿電泳方向每隔1～2 mm取一個XRF譜。

1.5 數據處理

采用AXIL軟件，并用來源于空氣且含量恒定的Ar信號峰對其它信號峰進行歸一化。用Mathematic軟件擬合各點，得到擬合曲線，并求出擬合曲線下面積，以信號峰面積表示相應位置的金屬相對含量。將同一條帶內各位置鐵信號峰面積對取譜位置作圖，曲線下總面積即代表該條帶內的鐵含量。

2 結果與討論

2.1 肝胞液中鐵含量分布(圖1)

a.薄層等電聚焦電泳條帶中各位置點的鐵含量分布 b.不同等電點所對應的鐵含量分布

從圖1可以看出，肝胞液中共有3處鐵相對記數較高，分別位于正極端、距正極端34 mm處以及距正極端43 mm處，相應的等電點分別為3.0、4.7和5.7。鐵超載后，3處的鐵含量均較正常顯著增加。

2.2 線粒體中鐵含量分布(圖2)

a.薄層等電聚焦電泳條帶中各位置點的鐵含量分布 b.不同等電點所對應的鐵含量分布

從圖2可以看出，線粒體中含鐵蛋白主要分布在等電點5.7和7.0處。鐵超載后，2處的鐵含量均較正常顯著增加，且分布的范圍變寬。

2.3 微粒體中鐵含量分布(圖3)

a.薄層等電聚焦電泳條帶中各位置點的鐵含量分布 b.不同等電點所對應的鐵含量分布

從圖3可以看出，微粒體同肝胞液一樣，也有3處鐵相對記數較高，分別位于正極端、距正極端27 mm處以及距正極端37 mm處，相應的等電點分別為3.0、5.7和7.3。鐵超載后，等電點5.7處的鐵含量較正常顯著增加，其它兩處均無明顯變化。

2.4 討論

肝臟是體內非常重要的臟器之一，具有多種生理功能，在碳水化合物、脂質以及蛋白質的代謝中都起著十分重要的作用。肝臟除了具有合成血清蛋白(如白蛋白、抗體、纖維蛋白素原)、尿素、凝血素以及其它凝血因子等功能外，還是一個解毒中心，可以清除內源性或外源性的毒性物質[17]。

生物組織中微量元素的研究不僅具有生物學意義，而且在臨床和病理學上也具有十分重要的作用。不同的病因導致組織中微量元素新陳代謝的改變，從而形成不同物質[17]。鐵超載可導致機體損傷，尤其是肝臟損傷。因此，研究鐵超載后肝臟中鐵蛋白的含量及分布對于認識微量元素鐵過多產生的生物學意義很有幫助。生物樣品中金屬蛋白分布的研究方法一般是將樣品中的蛋白質分離后測定其中的金屬含量[12]。但由于生物樣品的復雜性，研究生物樣品中金屬蛋白分布要求高效、高分辨率的蛋白質分離方法以及高靈敏度的微量元素檢測方法，這也是本實驗采用薄層等電聚焦-X-射線熒光光譜法分析鐵超載后小鼠各亞細胞器蛋白中鐵含量分布的原因。本實驗將薄層等電聚焦凝膠進行干燥處理后再進行X-射線熒光分析，從而大大減弱了由凝膠材料所引起的光源康普頓散射。

肝臟是含鐵化合物進行代謝和貯存的主要器官。實驗發現：鐵超載后，肝臟中鐵含量顯著增加，而且無論是肝胞液、線粒體還是微粒體，鐵含量均較正常組顯著增加。但3個亞細胞器鐵含量的增加量具有一定差異性，且存在如下關系：微粒體>肝胞液>線粒體。其原因可能是機體攝入的鐵被消化道吸收后，主要在肝細胞微粒體中進行代謝而被肝細胞吸收。另外，肝胞液和微粒體正極端附近的鐵相對記數較高，這說明肝胞液和微粒體中存在某些帶有負電荷的含鐵蛋白，但具體形式還有待進一步證實。肝胞液中另外還有2處鐵相對記數較高，其等電點分別為4.7和5.7，其中4.7與轉鐵蛋白的等電點一致，5.7與鐵蛋白的等電點一致。與肝胞液和線粒體相比較，盡管微粒體中含鐵蛋白也有3處分布，但鐵超載后，微粒體中含鐵量增加相對集中，增加的含鐵蛋白的等電點位于5.7處，這可能是因為鐵的貯存及代謝都主要發生在肝微粒體中的緣故。上述現象表明，鐵超載可導致肝胞液、線粒體和微粒體3個亞細胞器中鐵含量顯著增加，但因不同亞細胞器具有不同的生物學功能，所以3個亞細胞器的鐵含量分布也具有一定差異性。

3 結論

采用薄層等電聚焦-X-射線熒光光譜法對鐵超載小鼠肝中鐵含量的分布進行了研究。結果表明：機體攝入過量鐵，肝胞液、線粒體以及微粒體中鐵含量都較正常小鼠顯著增加，且增加的量存在如下關系：微粒體>肝胞液>線粒體；肝胞液中含鐵蛋白主要分布在等電點3.0、4.7和5.7處，線粒體中含鐵蛋白主要分布在等電點5.7和7.0處，微粒體含鐵蛋白主要分布在等電點3.0、5.7和7.3處；鐵超載后，肝胞液和線粒體各處鐵含量均顯著增加，而微粒體中所增加的鐵主要集中在等電點5.7處。

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