高效液相色譜串聯質譜分析黃芩水煎液的有效成分※

何秋毅宋偉峰馬斌李瑞明陳 孝

高效液相色譜串聯質譜分析黃芩水煎液的有效成分※

何秋毅1宋偉峰2馬斌1李瑞明1陳 孝1

目的采用高效液相色譜串聯質譜（HPLC-MS/MS）聯用技術，對黃芩水煎液中的有效成分進行初步分析。方法采用 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱，以乙腈和水（含體積比 0.5%甲酸）為流動相，采用梯度洗脫，流速為0.4mL/min，ESI-MS采用負離子模式。通過HPLC-MS/MS在線測定化合物的一級和二級質譜信息，結合文獻報道，對黃芩水煎液的有效成分進行分析鑒別。結果結合文獻報道和質譜數據，21個成分通過串聯質譜進行了結構鑒定，4個通過對照品得到了確證。結論高效液相色譜串聯質譜法是鑒定黃芩藥材化學成分的有效方法。

黃芩；水煎液；化學成分；高液相色譜串聯質譜

黃芩（Radix Scutellariae）為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根[1]。黃芩是中國藥典收載品種，產于河北、遼寧、陜西、山東、內蒙古、黑龍江等地，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎，用于濕溫、暑濕，胸悶嘔惡，濕熱痞滿，瀉痢，黃疸，肺熱咳嗽，高熱煩渴，胎動不安等[2]。現代研究證明，黃芩主要含黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、漢黃芩苷、黃芩新素、β-谷甾醇等成分[3-5]。它的抗菌譜較廣，對多種細菌、皮膚真菌、鉤端螺旋體等都有抑制作用；另外，還具有抗炎和抑制流感病毒、乙型肝炎病毒的作用[6-8]。

隨著分析科學的不斷發展，液質聯用技術已廣泛用于中藥及生物樣品的分離分析。串聯質譜具有分析速度快、靈敏度高、能給出分子結構信息等優點，采用高效液相色譜串聯質譜（HPLC-MS/MS），可以獲取各化合物的一級和二級質譜信息，從而迅速對中藥化學成分進行快速分析鑒別。另外，由于中藥飲片主要采用水煎煮的方式服用，研究其水提取液的化學成分具有重要的意義。本文采用高效液相色譜串聯質譜（HPLC-MS/MS）分析黃芩水煎液中的有效成分，為黃芩的物質基礎和作用機理研究奠定了基礎。

圖1 黃芩水提取液的總離子流圖

表1 黃芩水提取液的HPLC-MS分析結果

1 儀器與試劑

Agilent1100高效液相色譜儀（配有DAD檢測器、自動進樣器、四元泵），6410B QqQ-MS電噴霧串聯質譜儀（美國Agilent公司)，配有MassHunter數據處理系統；色譜柱：ZORBAX SB-C18高效液相色譜柱（100mm×2.1mm，3.5μm，美國 Agilent公司）。色譜流動相甲醇、乙腈為色譜純（德國Merck公司），甲酸為分析純（廣州化學試劑廠），實驗用水為 Milli-Q超純水。黃芩藥材購自廣州采芝林藥店，經鑒定為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。

2 方法與結果

2.1樣品提取取黃芩藥材適量粉碎，準確稱取10g置圓底燒瓶中，加100mL水，回流提取2h，提取液冷卻后轉移至 100mL的容量瓶中，定容后過0.45μm濾膜，作為供試品溶液。

2.2色譜及質譜條件色譜條件：ZORBAX SBC18高效液相色譜柱（100mm×2.1mm、3.5μm）；流動相A為0.5%的甲酸溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序如下：0～2min，0%B；2～5min，0%～12%B；5～25min，12%～30%B；25～35min，30%～60%B；35～45min，60%～95% B；45.1min，0%B保持10min。流速0.4mL/min；進樣量：5.0μL，柱溫：25℃。

質譜條件為電噴霧離子源，負離子掃描模式；噴霧氣壓力：40psi；干燥氣（N2）流速：10.0L/min，干燥氣溫度：350℃；毛細管電壓：4000V，碎裂電壓：100V，錐孔電壓：60V，碰撞能量0～20V，質量數掃描范圍為50～1500m/z。

2.3成分分析圖1為黃芩藥材水提取液的HPLCMS分析總離子流色譜圖，色譜圖上有30個明顯的色譜峰，通過與相關文獻[9-10]比較每個色譜峰一級質譜信息、二級質譜信息以及C18色譜柱的洗脫順序，其中的21個化合物得到了推測鑒定，這些化合物的保留時間、一級質譜、多級質譜和分子式詳細信息見表1，詳細色譜圖信息見圖1。其中10、20、23、27號色譜峰分別是黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素，這四個色譜峰通過與對照品對照比較保留時間、一級質譜和多級質譜信息得到了確證。黃芩主要含有黃酮類化合物，其中黃酮苷類包括碳苷（如白楊素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷）和氧苷類化合物（如黃芩苷）。碳苷是一類特殊的化合物，其糖基以 C-C鍵直接連在苷元的碳原子上。白楊素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷(2)為碳苷，在二級質譜中，能夠觀察到[M-H-60]-、[M-H-90]-和[M-H-120]-的信號，與黃酮碳苷質譜裂解的特征信號一致。黃芩苷(10)、漢黃芩苷(20)等氧苷在二級質譜中則明顯失去一份子的葡萄糖醛酸，得到[M-H-176]-的信號。其它 9個色譜峰由于缺乏相關的文獻報道和對照品，結構有待進一步分析鑒定。

3 討論

HPLC-MS/MS是分析黃芩有效成分的強有力工具，通過采用串聯質譜分析化合物的一級和二級質譜信息，可以大致推測出化合物的結構和類型，從而在沒有標準品的條件下，也能對黃芩中的有效成分進行定性。本實驗通過對黃芩水煎液進行了HPLC-MS/MS分析，研究了其水溶性的化學成分，通過HPLC分離共得到了30個化合物，其中鑒定了21個化合物。黃芩主要含有黃酮類成分，本研究能快速的分析鑒定黃芩中的黃酮類成分，同時還能根據質譜的特征離子，鑒定黃芩中特殊的碳苷化合物。本方法具有快速、靈敏度高的特點，可以作為黃芩藥材鑒定的有效方法。

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Identification of the Major Components From the water Extract of Radix Scutellariae by High-performance Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

He Qiuyi Song Weifeng Ma Yanbin Li Ruiming Chen Xiao

ObjectiveTo identify the active components in Radix Scutellariae by high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS).MethodsThe separation was performed on an Agilent ZORBAX SB-C18 column with gradient elution of acetonitrile and water (containing 0.5% formic acid)as mobile phase,the flow rate was 0.4 mL/min.On-line ESI-MS/MS in negative mode was used to obtain the MS1 and MS2 data of the analytes.ResultsAccording to the literature and high-resolution data,21 compounds were identified by HPLC-MS/MS and 4 of them were confirmed by a comparison of their tR,MS data with those of the reference substances.ConclusionHPLC-MS/MS is demonstrated as a powerful tool for the rapid identification of the chemical constituents in Radix Scutellariae.

Radix Scutellariae; Water extract; Components; High-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

1 中山大學附屬第一醫院藥學部，廣東廣州 510080

2 中山大學附屬第三醫院藥學部，廣東廣州 510630

廣東省重大科技專項項目（2011A080300004）；廣東省中醫藥局科研項目（20121145）

何秋毅（1981.9-），男，本科，藥師，主要研究方向為臨床藥學。

李瑞明（1974.7-），男，本科，主管藥師，主要研究方向為醫院制劑。E-mail：liruiming321@163.com.