自體MSCs/Chondro－Gide?工程化軟骨再生修復(fù)技術(shù)的大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

左鎮(zhèn)華，米彥軍，方禮明，林 娜，張 軍，鄭繼元，楊 柳

關(guān)節(jié)軟骨損傷及其修復(fù)，長(zhǎng)期以來(lái)是困擾骨科基礎(chǔ)研究與臨床治療的棘手問(wèn)題。隨著高能高速創(chuàng)傷的不斷增多及人口老齡化進(jìn)程，導(dǎo)致和加速關(guān)節(jié)軟骨損傷和退變的疾患將顯著增加。目前臨床治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法均存在缺陷。因此，開(kāi)發(fā)一種新型軟骨再生修復(fù)技術(shù)具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)在AMIC技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合干細(xì)胞移植技術(shù)［1］，通過(guò)關(guān)節(jié)鏡或小切口微創(chuàng)方式進(jìn)行關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)，具有操作簡(jiǎn)單，創(chuàng)傷小等特點(diǎn)，避免了軟骨細(xì)胞取材對(duì)供區(qū)的損傷，減省了體外軟骨構(gòu)建過(guò)程，借助關(guān)節(jié)腔的生物及力學(xué)環(huán)境更有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自我誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)損傷部位軟骨修復(fù)，從而為軟骨損傷修復(fù)的臨床前實(shí)驗(yàn)提供大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 Stryker關(guān)節(jié)鏡系統(tǒng)、JVC視頻監(jiān)視系統(tǒng)、Stryker電動(dòng)削刨系統(tǒng)、帶刻度的關(guān)節(jié)鏡探針、microfracture手錐、電動(dòng)磨鉆，骨髓穿刺包，DMEM培養(yǎng)液:含有L－谷氨酰胺300 μg/ml，維生素C 50 300 μg/ml，青霉素及鏈霉素各100 μg/ml的無(wú)血清DMEM(美國(guó)Gibco)培養(yǎng)液，Chondro－Gide?Ⅰ/Ⅲ型膠原雙層薄膜支架(瑞士蓋氏公司)，Percoll分離液，優(yōu)質(zhì)胎牛血清(美國(guó)Hycline Logan)，磷酸鹽緩沖液(PBS)，醫(yī)用生物蛋白膠(廣州倍繡生物技術(shù)有限公司)，SHEL－LAB2300型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Sheldo)，IX70－CK2型生物倒置顯微鏡(日本Olympus)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 中國(guó)青山羊12只，12月齡，體重14.5～15.5 kg，雌雄不限，雄性未去勢(shì)(第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建立山羊關(guān)節(jié)軟骨缺損模型

1.3.1.1 制造4 cm2缺損區(qū)域微骨折最大數(shù)并計(jì)算干細(xì)胞移植的細(xì)胞量 在處死山羊的股骨滑車(chē)上制造軟骨缺損4 cm2，用關(guān)節(jié)鏡微骨折手錐(孔徑2.5～2.8 mm，深度3～4 mm，孔間間隔為2～3 mm)最大限度制造微骨折;測(cè)量微骨折手錐的尖端直徑及長(zhǎng)度，測(cè)量制造的微骨折孔徑的直徑。

1.3.1.2 參照以下幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值 (1)臨床上注射的細(xì)胞懸液的濃度3 ×107/ml［2］;(2)4 ml成人骨髓含3.2×107～6.0×107個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)3周收獲hMSCs 2.5×107～4.3×107，4 ml成人骨髓培養(yǎng)3周所需血清30 ml［3］;(3)200 ml全血可提取血清120 ml(北京積水潭醫(yī)院檢驗(yàn)科提供數(shù)值)。

1.3.2 自體MSCs/Chondro－Gide?工程化軟骨修復(fù)技術(shù)具體步驟 (1)實(shí)驗(yàn)分組:12只成年中國(guó)青山羊，將山羊按序編為1～12號(hào)，隔離后驗(yàn)血，排除腦膜炎后隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、AMIC治療組及空白對(duì)照組，每組4只8膝。(2)采集山羊血液，培養(yǎng)自體血清通過(guò)山羊頸靜脈采集120 ml全血，制備自體血清。(3)骨髓的采集:肌注氯胺酮(10～20 mg/kg)后進(jìn)行稱(chēng)重。采用戊巴比妥鈉(20～30 mg/kg)靜脈復(fù)合麻醉，成功后以10%Na2S溶液褪去山羊膝關(guān)節(jié)手術(shù)區(qū)域毛發(fā)，以碘伏常規(guī)術(shù)區(qū)消毒、鋪巾，肝素化的無(wú)菌骨穿針以45°傾斜于股骨近端沿其長(zhǎng)軸的方向，進(jìn)入骨髓腔后抽取骨髓3～5 ml，置于肝素化的無(wú)菌離心管中。(4)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自體血清體外培養(yǎng)。(5)制備山羊膝關(guān)節(jié)股骨滑車(chē)關(guān)節(jié)面缺損模型以10%Na2S溶液褪去山羊膝關(guān)節(jié)手術(shù)區(qū)域毛發(fā)，以碘伏常規(guī)術(shù)區(qū)消毒、鋪巾，制作膝關(guān)節(jié)滑車(chē)部位4 cm2軟骨缺損模型。

1.3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作 制備骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液待用。實(shí)驗(yàn)組:首先清理關(guān)節(jié)軟骨缺損部位，修整周緣，用消毒后的鋁箔填充缺損部位，修剪鋁箔與軟骨缺損形狀及大小一樣作為模具，將模具覆蓋在Chondro－Gide?薄膜上，沿邊緣修剪;在軟骨缺損部位制造微骨折，注射纖維蛋白凝膠，將修整后的薄膜覆蓋缺損部位，將細(xì)胞懸液均勻注射在薄膜下，髕骨復(fù)位后被動(dòng)活動(dòng)膝關(guān)節(jié)，檢查薄膜固定牢固性;AMIC組:單純微骨折加貼薄膜;空白對(duì)照組:注入無(wú)菌生理鹽水1 ml。術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素，40萬(wàn)U/只，動(dòng)物肢體不固定，正常飲食，動(dòng)物自由活動(dòng)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 術(shù)后一般情況 動(dòng)物飲食量、肢體活動(dòng)、傷口愈合情況、有無(wú)全身或局部感染等。

1.4.2 關(guān)節(jié)鏡后膝關(guān)節(jié)MRI檢查 術(shù)后8周動(dòng)物麻醉后行關(guān)節(jié)鏡觀察及膝關(guān)節(jié)MRI檢查。

1.4.3 大體觀察 處死動(dòng)物，手術(shù)顯露膝關(guān)節(jié)，肉眼觀察關(guān)節(jié)有無(wú)粘連、有無(wú)關(guān)節(jié)內(nèi)游離體，以及修復(fù)組織色澤、修復(fù)面積、修復(fù)厚度及與周?chē)M織整合情況。

1.4.4 組織學(xué)觀察 大體觀察完成之后，截取修復(fù)的股骨遠(yuǎn)端，4%多聚甲醛固定48 h，0.5M的EDTA(由不含鈣、鎂的PBS配制，NaOH調(diào)整pH 7.8)脫鈣3周、每周更換脫鈣液2次，石蠟包埋切片，HE、TB染色。行組織形態(tài)和軟骨細(xì)胞分泌氨基多糖定性觀察。

1.4.5 修復(fù)效果評(píng)分 采用半定量改良的Wakitani評(píng)分法［4］，觀察修復(fù)組織細(xì)胞種類(lèi)、基質(zhì)染色、修復(fù)面積、軟骨厚度及與正常組織的整合情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件ANOVA方差分析法，分析三組軟骨修復(fù)Wakitani評(píng)分值，進(jìn)行各組間均數(shù)(±s)的比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 計(jì)算數(shù)值的結(jié)果 4 cm2軟骨缺損的微骨折孔數(shù)(Max):25個(gè);4 cm2軟骨缺損微骨折注入液體總量=25×13 μl=0.32 ml;4 cm2軟骨缺損注入液體總量=1.6 ml;細(xì)胞總數(shù)=3×107/ml×0.32﹢1.6×3×107/ml=4.6×107/ml;所需要采集的骨髓總量=7.36 ml～4.28 ml;所需血清50～60 ml;需采集全血最大量83～100 ml。

2.2 一般情況 修復(fù)術(shù)后次日，動(dòng)物活動(dòng)量及飲食較前略減少，術(shù)后3 d大多數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物恢復(fù)正常飲食，術(shù)后7 d全部恢復(fù)正常活動(dòng);術(shù)后7 d切口愈合，縫線自動(dòng)脫落。

2.3 術(shù)后8周關(guān)節(jié)鏡下觀察 實(shí)驗(yàn)組:關(guān)節(jié)腔滑膜無(wú)增生、充血，關(guān)節(jié)腔無(wú)積液，軟骨缺損部位邊界光滑，表面光滑無(wú)起層，彈性尚可。AMIC組:關(guān)節(jié)鏡下可見(jiàn)關(guān)節(jié)腔少量積液，滑膜有增生，修復(fù)區(qū)色澤較正常軟骨差別大，軟骨表面光滑但低于正常軟骨，彈性差。空白對(duì)照組:軟骨缺損仍存在，缺損周緣有類(lèi)似纖維肉芽組織增生(圖1)。

2.4 術(shù)后8周大體觀察 軟骨修復(fù)術(shù)后時(shí)，大體觀察:實(shí)驗(yàn)組:修復(fù)區(qū)表面平整，修復(fù)區(qū)域色澤較接近周?chē)＼浌牵吔邕B續(xù)無(wú)分裂;AMIC組:修復(fù)區(qū)表面較為平整，色澤暗紅與周?chē)＝M織區(qū)別明顯;空白對(duì)照組:仍可見(jiàn)明顯缺損，缺損底部肉芽組織形成。

2.5 術(shù)后8周膝關(guān)節(jié)核磁共振影像學(xué)評(píng)價(jià) (1)實(shí)驗(yàn)組:關(guān)節(jié)腔無(wú)積液，滑膜無(wú)增生，軟骨表面光滑，無(wú)缺損;(2)AMIC組:軟骨下骨有異常信號(hào)改變，軟骨表面較為光滑，髕下脂肪墊增生;(3)空白對(duì)照組:軟骨及軟骨下骨缺損，T2像可見(jiàn)關(guān)節(jié)腔少量積液(圖2)。

2.6 軟骨修復(fù)術(shù)后8周時(shí)，組織學(xué)觀察 (1)實(shí)驗(yàn)組:HE染色示修復(fù)區(qū)域與正常組織整合較好，有較多幼稚軟骨細(xì)胞，修復(fù)組織表層下方，細(xì)胞體積較小，形態(tài)多長(zhǎng)梭形，數(shù)量多，分布均勻，深層細(xì)胞體積較大，排列不規(guī)則，能見(jiàn)到伊紅深染的少量支架;(2)AMIC組:可見(jiàn)修復(fù)區(qū)整合尚可，表層下方類(lèi)似骨髓細(xì)胞聚集，細(xì)胞數(shù)量較少、體積小，排列不規(guī)則;(3)空白對(duì)照組:缺損區(qū)邊緣可見(jiàn)軟骨組織反應(yīng)性增生，但不能充填缺損，缺損底部為增生的纖維組織，并有毛細(xì)血管長(zhǎng)入(圖3)。

2.7 修復(fù)效果 Wakitani評(píng)分結(jié)果實(shí)驗(yàn)組8周、16周評(píng)分值與空白對(duì)照組相應(yīng)評(píng)分值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);實(shí)驗(yàn)組8周、16周評(píng)分值與AMIC組相應(yīng)時(shí)刻評(píng)分值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);AMIC組8周評(píng)分值與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);AMIC組16周評(píng)分值與空白對(duì)照組相應(yīng)時(shí)刻評(píng)分值比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，見(jiàn)表1。改良Wakitani評(píng)分結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組和AMIC組修復(fù)效果均優(yōu)于空白對(duì)照組，且實(shí)驗(yàn)組修復(fù)效果更優(yōu)于AMIC組。

圖3 軟骨修復(fù)術(shù)后8周組織學(xué)觀察(HE，×100)

表1 自體MSCs/Chondro－Gide?工程化軟骨修復(fù)技術(shù)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損Wakitani評(píng)分值(n=8;±s)

表1 自體MSCs/Chondro－Gide?工程化軟骨修復(fù)技術(shù)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損Wakitani評(píng)分值(n=8;±s)

注:與空白對(duì)照組比，①P＜0.01;與AMIC組比，②P＜0.01

組別 8周 16周實(shí)驗(yàn)組 4.63±1.18①② 3.95±1.02①②11.35±1.86 8.25±1.38 AMIC組 8.70±0.82① 7.06±1.13空白對(duì)照組

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)按照自體MSCs/Chondro－Gide?工程化軟骨修復(fù)技術(shù)修復(fù)山羊膝關(guān)節(jié)股骨滑車(chē)軟骨缺損，進(jìn)一步驗(yàn)證微創(chuàng)條件下臨床應(yīng)用的可行性，自體血清培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的可行性，利用膠原蛋白凝膠固定Chondro－Gide?薄膜固定方式的有效性，計(jì)算出一定面積的軟骨缺損需要采集的骨髓及全血最大量，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

3.1 間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)軟骨再生可行性分析 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在一定的誘導(dǎo)條件下，可向軟骨細(xì)胞分化，經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有軟骨細(xì)胞的形態(tài)和分泌軟骨基質(zhì)的能力。MSCs可來(lái)源于骨髓、骨膜或軟骨膜，具有多向分化潛能，根據(jù)環(huán)境的不同可分化為軟骨、骨、肌腱等。它們傳代繁殖能力強(qiáng)，連續(xù)多次傳代仍可保持良好的增殖分化活性，與基質(zhì)材料復(fù)合植入體內(nèi)后可在新生組織上部形成良好的透明樣軟骨，而在軟骨下區(qū)則形成骨組織，從而可達(dá)到很好的界面整合。其中，骨髓來(lái)源的MSCs(骨髓基質(zhì)干細(xì)胞bone marrow stem cells，BMSC)取材方便，分離和培養(yǎng)簡(jiǎn)單，成人一次骨穿取材后體外可連續(xù)培養(yǎng)30代以上，數(shù)量擴(kuò)增一百萬(wàn)倍以上而依然保持良好的多向分化潛能。而且，雖然BMSC濃度隨年齡增長(zhǎng)而下降，但其活性依然良好，故有些專(zhuān)家認(rèn)為BMSC是關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的首選種子細(xì)胞［5－7］。

3.2 自體血清培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的可行性分析 組織工程骨從種子細(xì)胞的體外擴(kuò)增到組織的構(gòu)建與成熟都離不開(kāi)血清，不同種類(lèi)甚至不同批號(hào)的血清對(duì)于MSCs的貼壁、擴(kuò)增以及多系潛能的維持均有不同的效果［8］。目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)普遍使用的都是牛血清，而組織工程走向臨床需要符合生物安全性的產(chǎn)品，為了避免異種血清帶來(lái)的免疫原，無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)將是今后的發(fā)展方向，但是目前其促增殖效率尚不滿意，自體血清代替動(dòng)物血清可能是今后一段時(shí)期內(nèi)的解決方案［9］。臨床上如采用自體血清培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞獲取足夠的種子細(xì)胞符合倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。

3.3 關(guān)節(jié)鏡下制備膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的優(yōu)越性 研究證實(shí)關(guān)節(jié)的機(jī)械應(yīng)力決定關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù);開(kāi)放性手術(shù)具有視野清楚、操作方便的優(yōu)點(diǎn)，但其創(chuàng)傷較大，有可能造成一些不可逆的關(guān)節(jié)損害，破壞關(guān)節(jié)的正常應(yīng)力，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)關(guān)節(jié)鏡制備了山羊膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型。在不打開(kāi)關(guān)節(jié)囊、不破壞關(guān)節(jié)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的條件下完成了關(guān)節(jié)腔內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨缺損的制備、microfracture治療及種子細(xì)胞的注入。術(shù)后關(guān)節(jié)腔未發(fā)生感染，關(guān)節(jié)功能恢復(fù)較快。進(jìn)一步證實(shí)設(shè)計(jì)方案是切實(shí)可行的［10］。

3.4 利用膠原蛋白凝膠固定Chondro－Gide?薄膜可行性 通過(guò)動(dòng)物模擬實(shí)驗(yàn)，術(shù)中能不損傷正常組織情況下簡(jiǎn)單、有效牢固地固定薄膜，無(wú)脫落、起層、皺褶的發(fā)生，術(shù)后在不制動(dòng)的條件下膝關(guān)節(jié)MRI影像學(xué)檢查證實(shí)薄膜無(wú)脫落，關(guān)節(jié)鏡探查進(jìn)一步證實(shí)移植物無(wú)脫落，組織學(xué)檢測(cè)證實(shí)移植物和正常組織結(jié)合較好。并且，該操作可以在關(guān)節(jié)鏡下進(jìn)行，具有簡(jiǎn)易性、微創(chuàng)性、快捷性等特點(diǎn)，因此該固定方式臨床應(yīng)用切實(shí)可行。

3.5 關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的可能途徑 體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨損傷后可能的修復(fù)途徑有:(1)注射的MSCs向病灶部位定向遷移，局部自我誘導(dǎo)分化［11］;(2)損傷周?chē)鷺O少數(shù)軟骨細(xì)胞的有絲分裂;(3)microfracture后軟骨下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化;局限于軟骨層的缺損，缺損邊緣極少數(shù)軟骨細(xì)胞可出現(xiàn)有絲分裂現(xiàn)象，基質(zhì)和細(xì)胞增殖遷移，合成基質(zhì)增加，呈現(xiàn)有限的內(nèi)源性修復(fù)。全層軟骨缺損，軟骨下骨MSCs進(jìn)入缺損區(qū)，在特定環(huán)境中向軟骨細(xì)胞分化修復(fù)缺損［12］;(4)干細(xì)胞移植增加骨髓間充質(zhì)細(xì)胞在缺損部位的有效濃度［13］。

3.6 存在的問(wèn)題與不足 本實(shí)驗(yàn)軟骨組織在物種之間差異很大，因此軟骨缺損模型的選擇上，馬等大動(dòng)物能更好模擬人的關(guān)節(jié)力學(xué)和生物學(xué)。此外，觀察期較短，缺乏6個(gè)月以上組織學(xué)檢查及關(guān)節(jié)鏡、膝關(guān)節(jié)MRI觀察;沒(méi)有對(duì)修復(fù)軟骨組織進(jìn)行相關(guān)力學(xué)測(cè)試，所修復(fù)透明軟骨樣組織能否長(zhǎng)期保持，是否發(fā)生軟骨退化，是否具備關(guān)節(jié)軟骨的力學(xué)要求都需要進(jìn)一步追蹤研究。

本實(shí)驗(yàn)在術(shù)后的關(guān)節(jié)制動(dòng)及后期的康復(fù)性功能鍛煉沒(méi)有很好的模擬驗(yàn)證。隨著研究的進(jìn)一步深入，種子細(xì)胞、生物支架以及組織構(gòu)建等方面不斷優(yōu)化改進(jìn)，相信在不久的將來(lái)，組織工程技術(shù)將給以組織和器官修復(fù)為主的外科學(xué)帶來(lái)革命性變化和廣闊的臨床應(yīng)用前景。

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