BNIP3基因在喉癌中的表達情況及影響因素

高晨 劉輝 吳宇 姚錫宇

喉癌是頭頸部常見腫瘤之一，以鱗狀細胞癌最多見。目前其主要治療手段為手術切除配合放射治療、化學治療。早期發現、早期診療對于減輕喉癌的危害非常重要，可提高患者術后生存率，也有可能盡量保留喉的發音功能，減少術后并發癥的發生。因此，通過對喉癌的發生、發展以及轉移機制的深入研究，在其基礎上發現特異且敏感的分子指標，并將其應用于高發地區或人群的普查中，實現喉癌的二級預防，這對提高喉癌的療效有著十分重要的意義[1]。

BNIP3基因全長1 535bp，位于10q26.3上。BNIP3是Bcl-2家族中促凋亡蛋白亞類的成員之一。因BNIP3基因在不同腫瘤中表達情況存在差異（乳腺癌中BNIP3基因高表達，胰腺癌中BNIP3基因表達沉默），且有關研究又發現BNIP3基因的表達缺失或過表達均可促進腫瘤發生和發展[2，3]，使得對BNIP3基因的研究成為相關凋亡基因研究的熱點。

本研究擬應用組織芯片免疫組化S-P染色技術，應用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，觀察喉癌中BNIP3基因的表達情況，探討BNIP3基因在喉癌中的表達情況及影響因素。

1 材料與方法

1.1 研究對象病例選自2005年1月～2018年12月我院頭頸外科治療的270例喉癌患者，男198例，女72例，平均年齡50.5歲，均經臨床和病理明確診斷，通過我院病案管理系統，收集整理患者臨床、病理資料，建立數據庫，所有患者術前檢查均未發現罹患有糖尿病、心血管疾病、神經系統疾病、肝炎、結核等病史，無術前放、化療等治療史，取其腫瘤組織細胞檢測，設為喉癌組；另取對應陰性切端的粘膜組織為對照組。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 ①BNIP3兔抗人多克隆抗體（工作濃度1∶200）；②二抗為即用型免疫組化Elivision plus試劑盒（鼠 /兔）（KIT 9901）。

1.2.2 儀器 ①切片機（NP-Q2）；②恒溫烤箱（XTJK200）；③冰箱（BCD-233GM型）；④普通光學顯微鏡（Olympus CX21）；⑤37.0℃恒溫孵育箱（TMC）。

1.3 結果判斷BNIP3免疫組化染色以胞漿內出現特異性染色深淺來進行評分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；再將染色細胞所占百分比來打分：陽性細胞數＜10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分，兩項乘積即為該例免疫組化得分，0 分，-；1～2 分，+；3～4 分，++；5～6 分，+++。 其中-為陰性，+～++為弱陽性，+++為強陽性，乘積大于6分者歸為強陽性

1.4 統計學方法采用SPSS 22.0統計軟件進行統計學分析，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BNIP3基因在喉癌組及對照組中的表達情況免疫組化結果示，喉癌組（270例）BNIP3基因表達陽性例數為126例，陽性率為46.7%，對照組（270例）中陽性例數220例，陽性率為81.5%。與對照組比較，喉癌組BNIP3基因表達陽性率明顯降低，差異有統計學意義（χ2=11.2，P＜0.05）。

2.2 BNIP3基因在不同浸潤深度喉癌中的表達情況免疫組化結果示淺度浸潤組（T1-2，98例）BNIP3基因表達陽性例數為66例，陽性率為67.3%，深度浸潤組（T3-4，172例）陽性例數60例，陽性率為34.9%，對照組（270例）中陽性例數220例，陽性率為81.5%。①與淺度浸潤組比較，深度浸潤組BNIP3基因表達陽性率明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；②與對照組比較，淺度浸潤組和深度浸潤組BNIP3基因表達陽性率有不同程度降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 BNIP3基因在不同淋巴結轉移情況的喉癌中的表達情況免疫組化結果示無淋巴結轉移組（78例）BNIP3基因表達陽性例數為42例，陽性率為53.9%，有淋巴結轉移組（192例）陽性例數為84例，陽性率為43.8%，對照組（270例）中陽性例數220例，陽性率為81.5%。①與無淋巴結轉移組比較，有淋巴結轉移組BNIP3基因表達陽性率明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；②與對照組比較，無淋巴結轉移組及有淋巴結轉移組BNIP3基因表達陽性率有不同程度降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 BNIP3基因在不同TNM分期喉癌中的表達情況免疫組化結果示早期喉癌組（62例）BNIP3基因表達陽性例數為39例，陽性率為62.9%，中晚期喉癌組（208例）陽性例數為87例，陽性率為41.8%，對照組（270例）中陽性例數220例，陽性率為81.5%。①與早期喉癌組比較，中晚期喉癌組BNIP3基因表達陽性率明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；②與對照組比較，早期喉癌組和中晚期喉癌組BNIP3基因表達陽性率有不同程度的降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.5 BNIP3基因在不同分化程度喉癌中的表達情況免疫組化結果示高分化組（80例）BNIP3基因表達陽性例數為50例，陽性率為62.5%，中分化組（132例）陽性例數為63例，陽性率為47.7%，低分化組（58例）陽性例數為13例，陽性率為22.4%，對照組（270例）中陽性例數220例，陽性率為81.5%。①與高分化組比較，中分化組和低分化組BNIP3基因表達陽性率均有不同程度降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；②與中分化組比較，低分化組BNIP3基因表達陽性率顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；③與對照組比較，高分化組、中分化組及低分化組BNIP3基因表達陽性率均有不同程度降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

此外，胞漿內的特異性染色（BNIP3）在周邊區域的癌細胞中表現為深染，比腫瘤中心區域和正常粘膜區域的染色深（見圖1）。

圖1 喉癌周邊區域癌細胞染色情況

3 討論

喉癌細胞中BNIP3基因表達陽性率低于粘膜組織中BNIP3基因表達陽性率說明其可能通過某些機制導致BNIP3基因表達沉默。本研究中深度浸潤組BNIP3基因表達陽性率明顯低于淺度浸潤組及對照組。表明BNIP3基因的表達可能與浸潤深度有一定聯系。

Yanmshita等[4]研究發現BNIP3基因的表達與淋巴結轉移情況呈正相關。本研究中：與無淋巴結轉移組比較，有淋巴結轉移組BNIP3基因表達陽性率明顯降低，說明喉癌中BNIP3基因的表達可能與其淋巴結轉移與否有一定關系。

TNM分期系統是目前國際上最為通用的腫瘤分期系統，是對惡性腫瘤進行分期的標準方法。本研究中：與早期喉癌組比較，中晚期喉癌組BNIP3基因表達陽性率明顯減低；與對照組比較，早期喉癌組和中晚期喉癌BNIP3基因表達陽性率有不同程度降低。說明喉癌中BNIP3基因的表達可能與其TNM分期相關。腫瘤細胞的分化程度是指腫瘤細胞接近于正常細胞的程度。腫瘤細胞的分化程度越差，其惡性程度就越高，且容易發生轉移。Abe等[5]研究發現：低分化胰腺癌BNIP3基因表達陽性率顯著降低。本研究亦發現：低分化喉癌BNIP3基因表達陽性率明顯降低。本研究中：與高分化組比較，中分化組和低分化組BNIP3基因表達陽性率均有不同程度減低；與中分化組比較，低分化組BNIP3基因表達陽性率顯著降低，這表明分化程度越低，喉癌中BNIP3基因表達降低越明顯。

缺氧是實體腫瘤發展過程中持續存在的情況。當缺氧達一定程度后，即可引起腫瘤細胞蛋白質組的改變和/或細胞內信號傳導過程，導致細胞受損性生長或死亡（細胞周期阻滯、細胞分化抑制、細胞凋亡等）。HIF-1是缺氧作用機制中的核心轉錄因子。BNIP3基因屬于HIF-1應答基因之一[6]。本研究亦發現：胞漿內的特異性染色（BNIP3）在周邊區域的癌細胞中表現為深染（該區域易發生缺氧），比腫瘤區域和正常粘膜區域的染色深。由于喉癌周邊區域極易發生缺氧[7]，考慮缺氧可導致喉癌細胞中BNIP3基因的高表達。

由本研究可知：①喉癌細胞中BNIP3基因的表達異常降低；②喉癌細胞中BNIP3基因表達隨著腫瘤浸潤深度的進展而降低得更明顯；③伴有淋巴結轉移者，喉癌細胞中BNIP3基因表達陽性率降低較無淋巴結轉移者明顯；④喉癌細胞中BNIP3基因表達在中晚期降低更明顯；⑤分化程度越差，喉癌細胞中BNIP3基因表達降低越明顯。總之，喉癌細胞中BNIP3基因表達與浸潤深度、淋巴結轉移情況、TNM分期、腫瘤細胞分化程度有一定關系。

綜上所述，檢測BNIP3基因有望成為喉癌診治的新靶點及其預后判斷的分子標記物。為進一步明確BNIP3基因在喉癌發病中的作用機制，本研究后期或將考慮從細胞層面對其進行驗證。

本研究存在一定局限性，本研究為橫斷面研究，缺乏喉癌患者自身不同階段的動態資料，有待增加后期隨訪工作，行進一步研究；本研究只分析探討了幾個腫瘤病理特征與檢測指標的相關性，未對其他臨床及患者個人相關因素進行分析；且各組之間樣本量差別較大，可能會使結果產生一定的偏倚，有待進一步增加樣本量減小誤差。