油桃菌核病菌原分子檢測

摘 要: 通過病原菌形態學和致病性測定的方法對引起設施油桃花腐的病原菌進行了分離鑒定，采用PCR技術擴增病菌DNA-ITS基因，序列測定結果表明該片段序列與GenBank已有的Sclerotinia sclerotiorum序列的同源性達到100%。綜合2種方法鑒定結果， Sclerotinia sclerotiorum是引起設施油桃菌核病的致病菌。

關鍵詞: 油桃菌核病； 形態學； 致病性； rDNA-ITS測序

中圖分類號：Ｓ６６2．1 文獻標志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０（２０12）０2－0283－０3

Molecular detection of Sclerotinia sclerotiorum from nectarine

ZHOU Zeng-qiang1，WANG Li1，HOU Hui1，SU Ping1，TIAN Juan2

（1Zhengzhou Fruit Research Institute of CAAS， Zhengzhou，Henan 45009 China； 2Anhui Province Dangshan Horticultural Field，Dangshan，Anhui 235300 China）

Abstract: A pathogenic fungus causing flower rot of greenhouse-grown nectarine was isolated and characterized based on the pathogenic morphology and pathogenicity. By using polymerase chain reaction （PCR）technique to amplify rDNA-ITS of the isolate， the results revealed that rDNA-ITS sequence of the isolate and Sclerotinia sclerotiorum shared 100% homology， which was compared in NCBI GenBank. Synthesized two identification results indicate that Sclerotinia sclerotiorum was the pathogen causing nectarine sclerotinia.

Key words: Nectarine Sclerotinia blight； Pathogenic morphology； Pathogenicity； rDNA-ITS sequencing

由核盤菌引起的菌核病是油菜、向日葵、番茄、醉蝶、川芎等作物上的一種重要病害[1-5]，該菌寄主范圍甚廣，可侵染42科約400種植物[6]。但在桃樹上，80年代，該病僅在福建省浦城縣[7]、上海郊區[8]報道。國外的文獻資料也多集中在煙草、蔬菜、觀賞植物上，桃樹上很難見到報道。近年來隨中國北方地區保護地油桃栽培面積的擴大，設施內花期前后常見的低溫、濃霧、高濕條件極有利于該病發生，我們于2009年在安徽省碭山縣園藝場日光溫室油桃品種上發現該病，造成花期前后油桃棚中桃花腐敗、嫩葉枯萎等現象。為了建立該病害的有效防治方法并為病害流行預測提供基礎資料，我們對該病害做了病原菌形態特征培養，致病性測定及病原菌基因組ITS區序列測定，對其致病菌進行鑒定，以明確此種致病菌的種類。

1 材料和方法

1.1 病樣采集

2009年，在安徽省碭山縣和河南省南樂縣、三門峽市陜縣、靈寶市等大棚、日光溫室油桃中調查病害時，發現安徽碭山園藝場日光溫室中有油桃花腐爛的病害。五點取樣法采集此種發病油桃樹花、葉和花柱病組織各20個，并對典型發病癥狀進行描述和數碼照相。

1.2 病原菌分離與培養

將采集的病組織，在0.5%次氯酸鈉溶液中表面消毒1 min，無菌水沖洗，隨后在PSA培養基上于20～24 ℃下培養。3 d后純化，觀察菌落形態及顏色，5 d后將純化的病原菌轉置PSA斜面上低溫保存。

1.3 病菌生物學特性測定

1.3.1 溫度測定 于PSA培養基平板中央接種油桃菌核病菌餅，接后分別置10、15、20、25、30、35、40 ℃的人工氣候箱中培養，培養3～5 d后記載菌落擴展直徑。每個處理用一個培養皿平板，重復4次。

1.3.2 pH條件測定 用1 mol·L-1 HCl 和1 mol·L-1 NaOH調節PSA培養基的pH值，使其分別達到5.0、6.0、7.0、8.0后制成平板，隨后接種桃菌核病菌于培養皿中央，置20 ℃下培養，培養3～5 d記載不同pH值下菌落擴展直徑。每個處理用一個培養皿平板，重復4次。

1.4 致病性的測定

開花前從田間剪取即將開花的中油4號桃樹枝條，分別插入水瓶中，人工接種已培養好的桃菌核病菌餅（5 mm直徑），每個枝條各接2個花芽和葉芽，以不接種處理做對照。2個枝條為1個重復，共重復4次。接后置人工氣候箱中，再外加加濕器連續加濕，控制溫度在20 ℃，培養3～7 d后調查，記載花芽褐變等發病情況。隨后將已發病的桃樹病組織，按照上述1.2的方法再分離，觀察分離物培養特征和形態特征。

1.5 病原rDNA-ITS序列測定

1.5.1 基因組DNA提取 采用SDS-CTAB法提取基因組DNA[9]。

1.5.2 rDNA-ITS片斷的PCR擴增 用真菌生物核糖體DNA通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增，引物序列為ITS1：5＇TCCGTAGGTGAACCTGCGG3＇；ITS4：5＇TCCTCCGCTTATTGATATG C3＇。PCR總反應體系為25 μL，ddH2O 16.75 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol·L-1 ）2.5 μL，Taq酶（5 U·μL-1） 0.25 μL，引物ITS1 0.5 μL，引物ITS4 0.5 μL，模板（50 mg·L-1）2 μL。反應條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環，最后72 ℃延伸5 min。擴增產物（5 μL）用1%的瓊脂糖電泳檢測觀察電泳條帶。PCR產物委托上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

1.5.3 真菌PCR產物的測序結果分析 將分離所得的菌株進行rDNA-ITS基因測序，測序結果經BLAST與NCBI數據庫中的已知序列進行同源性比較，確定病原菌種的分類地位。

2 結果與分析

2.1 癥狀及危害情況

2.1.1 癥狀 在日光溫室中，當油桃芽萌動時病菌先侵染花朵，花朵自雄蕊及花瓣開始產生褐色水漬狀斑點，而后迅速蔓延至全花，使花朵變褐枯萎；濕度大時，病花朵迅速腐爛，花瓣等表面產生大量茂密的白色菌絲（圖版-A）。病菌從花的柱頭向下蔓延直到幼果，引起果腐或小幼果變黃枯萎，甚至落果。病菌危害葉片時，多從葉片的基部向葉尖發展，偶爾也可從葉尖開始，呈水漬狀擴展，隨即傳染到葉柄上，也長出大量茂密的白色菌絲，引起桃樹葉片枯萎（圖版-B）。

2.1.2 危害情況 2009—2010年在河南省三門峽、南樂等地大棚、日光溫室中于花期及花后調查，油桃菌核病無或零星發生，但在2009年安徽碭山園藝場日光溫室中調查，該病在油桃品種上造成明顯的花腐癥狀，并引起花柱褐腐及葉枯，油桃花腐的發病率一般在20%～30%，嚴重時發病率達80%。

2.2 病原物分離與培養

從花、花柱和葉片發病部位病菌分出率分別是90%、85%和70%。病菌在PSA培養基上，在20 ℃下，培養3～4 d后即可見菌絲堆積（圖版-D），開始形成圓形或近圓形菌核，初期外觀為白色，7～10 d以后變為黑褐色至黑色（圖版-E、圖版-F），內部組織為白色（圖版-G）。大小平均為3.17 mm（圖版-H）。菌核一般在菌落外圍較多，排列一圈較整齊，內部數量較少。

2.3 菌原的生物學特性測定

2.3.1 溫度 溫度對桃菌核病菌菌絲生長的影響結果表明（圖1），在10～25 ℃，桃菌核病菌均能生長，其中以15～20 ℃下擴展最快，為最佳生長溫度，30 ~40 ℃不生長。

2.3.2 pH pH對桃菌核病菌絲生長的影響結果表明（圖2），在pH值5～8桃菌核病菌均能生長，其中以pH為5～6時菌落擴展最快，pH為8時生長緩慢。

2.4 致病性測定

接種3 d后，即可見到明顯的花瓣褐變、柱頭枯萎等癥狀，并有明顯的白色菌絲出現（圖版-C）。采集發病組織再分離，從花柱、花瓣、嫩葉上均可分離到相同的桃樹菌核病菌，說明分離物具有致病性。

2.5 病原菌分子鑒定結果

擴增病原菌ITS-rDNA，獲得527 bp的片段，測序結果運用BLAST進行分析比較。結果表明供試菌株基因組ITS-rDNA序列與NCBI庫內的菌株Sclerotinia sclerotiorum的同源性達100%，同源性最高的菌株如表1所示，據此確認該致病菌為核盤菌。該菌為子囊菌亞門（Ascomycotina）、盤菌綱（Discomycetes）、柔膜菌目（Helotiales）、核盤菌科（Sclerotiniaceae）、核盤菌屬（Sclerotinia）。

3 討 論

由S. sclerotiorum引起的油桃樹菌核病與由Selerotinia fructigena、S. fructicola 或S. laxa引起的桃樹褐腐病有明顯差異，但桃褐腐病有時也被稱為桃樹菌核病，實際上2者是區別明顯的2種病害。桃樹菌核病（S. sclerotiorum）發生與特殊的生態環境有關。其中低溫和高濕條件是病害發生和流行的主要因素。北方日光溫室桃樹品種，開花前后正處于易發生凍害、冷害階段，若遇低溫，加上棚內高濕、濃霧條件，易導致病害發生和流行。致病性試驗結果也看出高濕條件下接種才可致病。根據病害對低溫、高濕條件的要求，在病害控制上可通過及時通風換氣，減少棚內濕度，同時加強棚內保溫措施可能是控制病害經濟有效的方法之一。 桃樹菌核病寄主范圍較廣，在棚內不要間作番茄、油菜等易感作物，防止病害發生交叉感染。李茹等[9]報道在PDA上，油菜菌核病3～4 d可長滿培養皿，4 d后產生菌核，7～10 d成熟，我們的結果與之類似，但在病菌生長溫度范圍上，我們測定的油桃菌核病適應范圍較窄，可能是菌株的來源不同所致，待進一步研究。（本文圖版見封3）

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