龍眼水通道蛋白基因(DLPIP1)的克隆與表達分析

摘 要： 應用蛋白質組學研究低溫脅迫下龍眼葉片蛋白質組變化時，發現PIP1 蛋白在龍眼低溫脅迫中上調表達。應用RACE 技術克隆龍眼水通道蛋白基因全長cDNA，命名為DLPIP1，基因登陸號為JN572691，長度為1 132 bp，包括1個900 bp的開放閱讀框，編碼299 個氨基酸序列，同源性分析表明，DLPIP1 在21 個不同植物中的一致性為90%~93%。應用生物信息學軟件對DLPIP1 氨基酸序列分析表明，含有7 個跨膜區，有2 個NPA 單元，其氨基酸殘基與MIP 家族蛋白保守區序列完全一致。氨基酸序列比對發現，該序列與其他物種PIP 質膜水通道蛋白氨基酸序列有很高的同源性。利用實時熒光定量技術對DLPIP1 在低溫脅迫下不同組織表達譜分析表明， DLPIP1 在龍眼根、莖、葉中都有表達，在根中的表達量最高，其次是莖和葉。DLPIP1 在低溫脅迫時，隨著低溫脅迫時間的延長而發生變化。這說明DLPIP1 蛋白在龍眼低溫逆境過程中起作用。

關鍵詞：龍眼； 水通道蛋白； 低溫脅迫； 克隆； 表達

中圖分類號：Ｓ６６7．2 文獻標志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０（２０12）０2－0225－０6

Cloning and expression of longan aquaporin （DLPIP1）gene

CHEN Hu1， HE Xin-hua1，2*， LUO Cong1， DENG Li-bao1， HU Ying1， LI Ming-juan1， YANG Li-tao1，3

（1College of Agriculture， Guangxi University， Nanning，Guangxi 530004 China； 2Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Lab， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning，Guangxi 530007 China； 3State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources， Guangxi University， Nanning，Guangxi 530004 China）

Abstract: The protein expressions under low temperature stress were studied using proteomics method．The results showed that the expression of DLPIP1 protein was up-regulated. The full length of DLPIP1 cDNA obtained by RT-PCR was 1 132 bp with a 900 bp open read frame which encoded a putative DLPIP1 protein with 299 amino acids. Comparison of the amino acid sequence homology among DLPIP1 proteins from 21 different species indicated that DLPIP1 protein had a range of 90% to 93% identity with homologues of other plants. Bioinformatics analysis demonstrated that DLPIP1 exhibited a typical structure with seven membrane-spanning domains and an internal symmetry showing two highly conserved NPA motifs and possessing the MIP family signal consensus sequence. The DLPIP1 amino acids showed high identity with the PIP plasmalemma subfamily of other 21 plant species by homology comparison analysis. Quantitative real-time PCR results showed that the DLPIP1 expressed in root， stem and leaf， while the amount of expressions were different in different organs. The mRNA of DLPIP1 was the most abundant in root， the least in leaf and stem. Furthermore， the mRNA of DLPIP1 changed with time extension under low temperature stress. These results suggested that DLPIP1 might be involved in function of chilling stress.

Key words: Longan； Aquaporins； Chilling stress； Clone； Expression

水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）是細胞膜上專一、高效的水擴散特異孔道蛋白，它提供了細胞的水分跨膜雙向運輸通道，是水進出細胞最主要的途徑，在各種逆境脅迫下，水分調節過程中起重要作用[1]。深入了解植物水通道蛋白在的水分吸收、運輸、利用等方面的機制，對培育抗逆植物有著重要的意義。目前，已從多種植物中克隆得到水通道蛋白，并發現水通道蛋白是個家族基因，如在擬南芥中得到35 種AQP 基因[2]，玉米中得到35 個[3]，水稻中得到33 個[4]，冰花中得到14 個[5]等。

目前已有大量文獻研究了水通道蛋白與各種逆境脅迫之間的應答關系[1]，但有關果樹AQP 的克隆和響應低溫脅迫機制的研究還較少，未見有關龍眼水通道蛋白研究的報道。為此，本研究從蛋白水平出發，應用RT-PCR 和RACE 技術克隆水通道蛋白基因全長，通過相關軟件分析該基因序列特征及相關結構域。利用熒光定量技術研究該基因在低溫脅迫下的表達模式，為深入了解其在逆境脅迫中的功能和龍眼抗寒分子機制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 植物材料及試劑

以盆栽1 a生龍眼品種石硤為材料，將長勢一致的幼苗搬入人工調控室（溫度為25 ℃，白/晝為16/8 h，相對濕度65%）適應一段時間后將苗放入4 ℃低溫處理室內分別在處理0（CK）、2、4、8、12、24、48、72 h，將采好樣品立即保存于－80 ℃冰箱備用。

大腸桿菌DH5α、pMD18-T 克隆試劑盒、dNTP、Taq DNA 聚合酶、凝膠回收試劑盒購自Bioer 公司；M-MLV 逆轉錄酶購自TaKaRa 寶生物工程有限公司（中國大連）公司，Real time-PCR 試劑盒購自天根公司，所用引物合成及測序由上海生工完成，其他試劑為國產分析純。

1.2 雙向電泳及凝膠分析

低溫脅迫龍眼葉片（4 ℃低溫處理0 h為對照，24 h為處理）蛋白質組學分析中，總蛋白提取、雙向凝膠電泳、圖像分析及差異蛋白的分析及鑒定參考Yang等[6]和游向榮[7]的方法。

1.3 總RNA 提取及cDNA 合成

利用SDS 法提取龍眼葉片總RNA，將提取的各處理RNA 濃度稀釋至同一濃度。cDNA 合成用M-MLV 逆轉錄酶，逆轉錄引物為Oligo（dT）18：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC（T）18-3'，具體步驟按說明書進行，完成后取4 μL PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢查并用紫外分光光度計檢測濃度后，再將不同處理cDNA 稀釋到同一濃度。

1.4 DLPIP1 基因的克隆

以MALDI-TOF-TOF/MS 分析鑒定的PIP1 蛋白氨基酸序列運用BLAST 程序在GenBank 進行搜索，選取同源性較高植物的核酸序列，利用DNAMAN 軟件設計基因上游兼并引物 PIP1F：5'-GC（A/G）AGGAAGCTGTG（C/G）（C/T）AC-3'，下游引物為逆轉錄加尾引物 3side：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'。然后根據已得到的基因3' 端，利用羅聰等[8]方法設計特異引物PIP1R1：5'-AGTGGACCAAGAACACTGCGAAGCC-3'；PIP1R2: 5'-CTCAG CACCAAGA CCATCACCCTTG-3' 獲得基因5'端。

擴增PIP1基因的PCR體系為25 μL，模板為不同處理cDNA 等體積的混合樣，具體操作按照說明書進行。PCR擴增參數為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s；58 ℃ 1 min；72 ℃ 2 min；35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，回收純化目的條帶，連接到pMD18-T載體，熱激轉化感受態細胞大腸桿菌DH5α，通過藍白斑篩選挑取白色菌落，經菌液PCR驗證為陽性克隆子后送上海生工測序，測序正確后拼接基因全長。并在基因ORF兩端設計引物PIP1F1: 5'-ATGGAAGGTAAGGAAGAGGATGTGA-3'；PIP1R3: 5'-TTAGGCCCTGGCCTTGAATGGAATG-3'，擴增、克隆、測序進行驗證。

1.5 DLPIP1基因生物信息學分析

用BioXM2.6預測該基因氨基酸序列；將龍眼DLPIP1基因核酸及其蛋白氨基酸序列提交NCBI，檢索DLPIP1基因與其他物種的同源性；利用Clustalx軟件構建DLPIP1基因氨基酸序列進化樹；在線網站（http://isoelectric.ovh.org/）計算該基因氨基酸的等電點和蛋白質分子質量；用WoLF PSORT在線軟件對基因進行亞細胞定位；用SOSUI signal軟件預測基因的信號肽；用ExPASy Proteomics Server軟件分析基因的親水性和跨膜結構預測；用SOPMA軟件預測基因的二級結構；用SMART和Motif Scan 軟件對DLPIP1蛋白的功能結構域進行分析。

1.6 DLPIP1表達的 Real time-PCR 分析

為了探明龍眼DLPIP1 基因在低溫脅迫過程中時空表達的變化，以不同低溫處理時間材料的cDNA 為模板，以龍眼β-actin 基因（EU340557.1）作為內參，采用 Real time-PCR 技術對DLPIP1 在低溫脅迫下不同時間和不同組織（根、莖、葉）下的表達模式進行分析，設計內參引物β-actinF:5'-CTGATGGACA GGTTATCACTATTGGT-3'， β-actinR: 5'-CAATCATGGATGGC TGGAAGA-3'；根據獲得的DLPIP1 基因全長序列設計熒光定量PCR特異性引物DLPIP1QF:5'-AGAGACTCCCATGTCCCTATTTTG -3'，DLPIP1QR:5'-GGCCAAGTGGACCA AGAACA-3'；反應在ABI7300熒光定量PCR儀上進行， 反應體系為20 μL， 具體方法參照天根公司熒光定量試劑盒Real Master Mix（SYBR Green Ⅰ）說明書。反應參數：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s；55 ℃ 45 s；72 ℃ 20 s；40個循環。按照 2-ΔΔCT法[9]計算出基因轉錄水平的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫龍眼差異蛋白質雙向電泳分析

本實驗以龍眼為材料，采用蛋白質雙向電泳技術對龍眼葉片低溫脅迫蛋白質進行IEF-SDS-PAGE分離，利用PDQuest 軟件對2-D 凝膠圖進行分析，共有45 個蛋白點被鑒定為相應低溫脅迫蛋白，并質譜鑒定出30 多個差異蛋白點，其中，質譜鑒定蛋白點30（PIP1 蛋白）在低溫脅迫下表現上調（圖1），說明PIP1 表達與低溫逆境之間存在一定關系。

2.2 DLPIP1 基因全長cDNA 的獲得

為進一步研究PIP1 基因與低溫脅迫的關系，以龍眼品種“石硤”幼苗不同低溫（4 ℃）處理時間的混合RNA為模板，逆轉錄引物為Oligo （dT）18 合成cNDA，再以cDNA 為模板，用兼并引物PIP1F 和3side 和特異引物PIP1R1，PIP1R2分別進行3′RACE 和5′RACE 擴增，分別得到超過500 bp（圖2-A）和超過800 bp（圖2-B）片段，經過回收、克隆、測序、拼接得到基因全長。為驗證拼接結果的正確性，設計ORF 引物PIP1F1 和PIP1R3，并將PIP1F1 和3side 引物擴增基因全長，結果分別得到長約900 bp（圖2-C）和1 200 bp（圖2-D）的條帶，對目的條帶回收，連接轉化，藍白篩選后送上海生工公司測序，拼接后得到1 132 bp 的序列，與拼接結果完全一致。BioXM2.6 分析顯示包含啟始密碼ATG 和終止密碼TAA，為PIP1 基因全長序列。該基因命名為DLPIP1，基因登錄號為JN572691。DLPIP1 的cDNA 包含一個900 bp（1~900 bp）的完整開放閱讀框，編碼299 個氨基酸的蛋白質，還包含232 bp的3' 非編碼區，在這區域有個22 bp ployA 尾巴（圖3）。

2.3 DLPIP1 基因生物信息學分析

用在線軟件（http://isoelectric.ovh.org/）預測DLPIP1 基因所編碼的氨基酸序列的等電點為8.8，蛋白質分子質量為31.9 ku；DLPIP1 的亞細胞定位在質膜； DLPIP1 信號肽分析顯示該蛋白不含信號肽，是一類膜蛋白，有7個跨膜區域；用ExPASy Proteomics Server 預測DLPIP1 疏水性最大值為2.667，最小值為-2.789；NetPhos 2.0 Server軟件分析顯示該蛋白有8 個Ser、2 個Thr和1 個Tyr 磷酸化位點；利用SOPMA 軟件完整的預測DLPIP1 的二級結構，結果發現有122 個α-螺旋占34.11%，隨機卷曲128 個占42.81%，延伸鏈60 個占20.07%，β-轉角9 個只占3.01 %，用SMART 和Motif Scan 軟件對DLPIP1 的蛋白功能結構域進行分析，結果顯示: 51-293 aa 為水通道蛋白保守區域，44~124 和125~286 aa 之間為 MIP 家族結構域，有2 個NPA單元，另外該基因具有MIP 基因家族序列的信號序列XINPAVTFG，說明龍眼DLPIP1 蛋白應屬于質膜水通道蛋白家族。該蛋白存在1 個cAMP 和cGMP 依賴蛋白激酶磷酸化位點RKLS，2 個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點TKGD 和SATD，2 個蛋白激酶C磷酸化位點SER 和TLK， 1 個C -末端定位信號ARA，10 個N-肉豆蔻?；稽cGVSKSN、GIAWAF、GMIFAL、GISGGH、GLLLAI、GLLLAR、GAICGA、GVVKGF、GINPAR和IGAALA。

2.4 DLPIP1基因同源序列分析

利用NCBI Blast 分別檢索與龍眼DLPIP1 的核苷酸和氨基酸同源的其他物種序列，發現該基因與其他物種核苷酸序列同源性在76%~83%，其中與橡膠樹（Hevea brasiliensis，GQ479823.1），葡萄（Vitis，DQ834696.1）；白楊（Populus，XM-002303560.1）陸地棉（Gossypium hirsutum，DQ402075.1）的同源性為83%、82%、82%、81%，氨基酸序列同源性分別為93%、92%、92%、93%，并與其他PIP1類型質膜蛋白序列同源性在90%以上，在水通道蛋白功能區域的氨基酸序列都高度保守。

用Clustalx 軟件構建DLPIP1 與其他物種的氨基酸序列進化樹（圖4）。22 個不同物種PIP1 類型質膜水通道蛋白被聚為7 個類群，DLPIP1 與其他7 個物種聚為一大類，其中與橡膠樹，陸地棉，蓖麻聚為一小類，親緣關系近。另外草莓和香石竹聚為一類，禾本科的甘蔗和水稻聚為一類，薔薇科的蘋果和西洋梨親緣關系近，聚為一類。而楊柳科的白楊單獨歸為一類。龍眼DLPIP1 蛋白基因與21 個物種質膜類水通道蛋白氨基酸序列聚類分析表明，龍眼水通道蛋白DLPIP1 與質膜類水通道蛋白基酸同源性均達到90% 以上，因此龍眼DLPIP1 蛋白應屬于質膜水通道蛋白家族。

2.5 DLPIP1 基因的表達分析

我們又從mRNA 水平上對轉錄特性進行了分析，結果發現DLPIP1 在不同組織中均有表達（圖5），為組成型表達。在整個低溫脅迫過程中DLPIP1 在根中的表達量最高，莖和葉中的表達量較低，除根在處理2 h 表達量出現先降趨勢，總體上DLPIP1 在低溫處理過程中出現先下降后升高趨勢。不同組織均在低溫處理 8 h 時達到峰值，根、莖、葉DLPIP1 的表達量分別為對照的 0.78倍、3.4 倍和4.5 倍。在處理 24 h后葉中表達量出現小幅度上升，而莖中表達量則降到最低值僅為對照的0.31倍，在根中變化不大。表明DLPIP1 受到了低溫脅迫的誘導表達與低溫脅迫有一定的關系。

3 討 論

AQP 廣泛存在于各種植物中，AQP 具有水分運輸、細胞的滲透調節、調節細胞內外水的平衡、調節細胞的脹縮、滲透脅迫響應、氣孔運動調節等功能，尤其在植物體內的跨膜運輸中主要通過水通道蛋白（尤其是原生質膜上的水通道蛋白）來實現[10-12]。在其諸多生理功能中水孔蛋白如何參與非生物脅迫（干旱、光、低溫等）的應答一直備受科研人員關注。近年來，AQP參與逆境脅迫（尤其是干旱脅迫）應答機制已有較多報道。本實驗以龍眼為材料，從蛋白質水平研究表明，DLPIP1 蛋白在低溫脅迫下表現上調，說明DLPIP1 基因與低溫逆境之間存在一定關系。為進一步研究DLPIP1 基因與低溫脅迫的關系，克隆了龍眼DLPIP1 基因全長，經過與其他物種的序列比對發現，該基因與其他物種的PIP1 質膜蛋白類型同源性很高，并在水通道蛋白功能區域的氨基酸序列高度保守。對龍眼DLPIP1 基因編碼的氨基酸序列進行功能預測發現多個不同類型的磷酸化位點，目前已有報道證明在脅迫下這些磷酸化位點被依賴于Ca2+的蛋白激酶所磷酸化，并且磷酸化水平與基因的水通道活性有關[13]。Johansson等[14]對水通道蛋白如何通過磷酸化調節水分運輸提出了假說。另外糖基化（Glycosylation）作用也可能調控植物AQPs 的活性，但在DLPIP1 中并沒用發現糖基化位點。

實驗從mRNA 水平上對轉錄特性分析表明DLPIP1 基因在轉錄水平上受到了低溫脅迫的誘導，并且長時間低溫脅迫，促使DLPIP1 基因表達量下降，可能是由于蛋白活性受到抑制，降低水通道蛋白通道活性，使植物體內水分流動受阻，減少水分流失，從而增強植物抵抗低溫的能力[1，15]。這與Arocaa 等[16]研究玉米水孔蛋白在低溫脅迫30 h以后才參與玉米的抗冷反應及大多數研究結果相一致。但不同組織的表達量存在差異，這與基因在植物體內的分布和行使的功能有關。另外，在低溫脅迫24 h時 DLPIP1表達量這與前期蛋白水平研究相反，可能是在低溫脅迫過程中水通道蛋白有一個適應階段。以上所述說明了水孔蛋白參與了龍眼的抗冷反應，下一步實驗將通過原核表達，抗體制備及轉基因等方面的研究，進一步探討DLPIP1 基因在龍眼低溫脅迫下的水分運輸機制，為龍眼抗寒機制研究積累理論資料。

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