DAPT阻斷Notch信號(hào)通路抑制去勢(shì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其成骨分化的作用研究*

鄭介柏， 劉旭良， 陳文雄， 方雄明， 劉貽運(yùn)

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第十二人民醫(yī)院， 廣東 廣州 510620)

骨質(zhì)疏松(osteoporosis OP)是以骨質(zhì)量的丟失以及骨組織的退變?yōu)樘卣鞯墓谴x疾病。常導(dǎo)致骨質(zhì)疏松性病理骨折，致殘率較高，已成為繼高血壓、糖尿病后的重大老年疾病［1］。目前國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病病因及愈后恢復(fù)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的增殖和分化密切相關(guān)［2］。Notch 通路是調(diào)節(jié)BMSC向成骨細(xì)胞的增殖與分化的關(guān)鍵通路之一［3，4］。據(jù)報(bào)道，激活 Notch通路可促進(jìn) BMSCs的增殖，但會(huì)抑制Notch通路可促進(jìn)BMSCs成骨分化。DAPT作為Notch信號(hào)通路的阻斷劑，能夠特異地阻斷γ分泌酶的作用，從而阻止Notch信號(hào)通路的活化［5］。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)應(yīng)用Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT，觀察阻斷Notch通路對(duì)于抑制SD大鼠BMSC增殖及誘導(dǎo)其定向成骨分化的作用。希望能為治療骨質(zhì)疏松性骨折提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雌性SD大鼠24只，12周齡，體重

250±30g(由廣州醫(yī)科大學(xué)大學(xué)城校區(qū)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，動(dòng)物級(jí)別SPF級(jí)。

1.1.2 試劑和儀器:雙能X線吸收骨密度儀(DXA)，倒置顯微鏡，12孔培養(yǎng)板，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠);二氧化碳恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱(Thermoforma，美國(guó));離心機(jī)(Optima XPN，美國(guó))1%戊巴比妥鈉，75%乙醇，DMEM溶液，DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)基，胎牛血清(賽泰諾，美國(guó))，0.25%胰蛋白酶，10%胎牛血清，地塞米松，維生素C，β－甘油磷酸鈉，DAPT美國(guó)Calbiochem公司。

1.2 方 法

1.2.1 模型建立:1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉;大鼠取俯臥位，腹正中切口，在輸卵管與子宮角交界處結(jié)扎，摘除卵巢，其中，陰性對(duì)照組(假手術(shù)組)僅在卵巢周圍切除少許脂肪組織，余手術(shù)操作同上;手術(shù)完畢后，清點(diǎn)手術(shù)器械，縫合關(guān)閉傷口;肌肉注射青霉素鈉20萬(wàn)單位，預(yù)防感染。(n=6)。

1.2.2 骨密度測(cè)量:術(shù)后12周，進(jìn)行雙能X線吸收骨密度儀(DXA)測(cè)量股骨、腰椎骨密度。

1.2.3 大鼠的BMSC分離培養(yǎng)及鑒定:造模成功后第12周，以頸椎脫臼法處死大鼠，處死的大鼠浸入75%乙醇10min，在SPF實(shí)驗(yàn)室中，無(wú)菌手術(shù)操作臺(tái)上分離取出雙側(cè)股骨和脛骨，切除長(zhǎng)骨兩端關(guān)節(jié)面及干骺端，顯露骨髓腔;吹打、抽吸將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞收集于離心管中，離心;利用DMEM重懸，之后按1∶1比例加入1.073g/mL Percoll液分離，吹打重懸，將細(xì)胞懸液，接種于 10cm培養(yǎng)皿中;之后，置入 37℃、5%CO2、100%飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)72h后，首次換液，以后每3天換液1次，細(xì)胞80% －90%融合后用0.25%胰蛋白酶消化，傳代。

1.2.4 誘導(dǎo)分化培養(yǎng):將第2代細(xì)胞換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中加入1×108moL/L地塞米松、50mg/L維生素 C、1×108moL/L β－甘油磷酸鈉)培養(yǎng)，進(jìn)行誘導(dǎo)分化。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況、形態(tài)特性。第2代傳代培養(yǎng)的細(xì)胞用誘導(dǎo)培養(yǎng)液以1×106/mL的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，每2－3d換液。共誘導(dǎo)培養(yǎng)3周。

1.2.5 DAPT溶液:完全溶于 DMSO，用 DMEM 培養(yǎng)液稀釋至1.00μmoL/L，DMSO 終濃度不超過(guò)0.1%。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)分組:DAPT治療組:培養(yǎng)液中含有濃度為1μmoL/L 的 DAPT，藥物濃度參考［6］。對(duì)照組:含等量DMSO的PBS注射液。

1.2.7 DAPT對(duì)MSC增殖的影響:MTT檢測(cè)各組BMSC的增殖:12孔培養(yǎng)板接種細(xì)胞，分別于誘導(dǎo)3、5、7、9、11d，分組換液，每組6復(fù)孔，每3－4d換液。選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，取6孔平均值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值(OD)為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.8 DAPT對(duì)BMSC成骨分化的影響:堿性磷酸酶(alkaline phosphatase;ALP)定量測(cè)定:12孔培養(yǎng)板接種細(xì)胞，分別于誘導(dǎo) 3d、5d、7d、9d、11d 各組取 6 孔，各取上清100uL，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，記錄結(jié)果，取6孔平均值(金氏單位U/100mL)，計(jì)算ALP活性。

2 結(jié)果

2.1 骨密度測(cè)量結(jié)果:與對(duì)照組比較，模型組大鼠腰椎及股骨骨密度下降明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。鋪滿瓶底，細(xì)胞為單層分布，第2代細(xì)胞，可見(jiàn)其集落樣生長(zhǎng)(如圖1B)。

2.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng):將BMSC第2次傳代后，加入誘導(dǎo)液進(jìn)行培養(yǎng)，第3－4d可觀察到細(xì)胞呈現(xiàn)梭型和多角形，其中胞體較普通的常規(guī)培養(yǎng)要大，到第7－8天可觀察到細(xì)胞突起多，細(xì)胞核較大，有些已經(jīng)形成細(xì)胞小結(jié)，具有了成骨細(xì)胞的形態(tài)特征(圖1C)。

2.3 生長(zhǎng)曲線(MTT方法):第2次傳代后1－3d的細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，從第5天開(kāi)始細(xì)胞增殖明顯加快，數(shù)量增加，對(duì)照組及DAPT組BMSC到第9天增殖達(dá)到最高峰(0.541 ±0.051;0.369 ±0.043)，而后回落。自第3天開(kāi)始，兩組之間的OD值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(n=6，P＜0.05)(圖2)

表1模型組及對(duì)照組的DXA測(cè)定結(jié)果(n=6，±s)

表1模型組及對(duì)照組的DXA測(cè)定結(jié)果(n=6，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.01

指標(biāo) 模型組 對(duì)照組腰椎 BMD(g/cm2) 0.217 ±0.041*0.284 ±0.032股骨 BMD(g/cm2) 0.169 ±0.021*0.223 ±0.027

2.2 BMSC體外培養(yǎng)的形態(tài)觀察，見(jiàn)圖1。

圖1 BMSC體外培養(yǎng)形態(tài)觀察結(jié)果

2.2.1 原代培養(yǎng):BMSC原代細(xì)胞的特點(diǎn)是:均勻散布于培養(yǎng)瓶底，細(xì)胞呈現(xiàn)圓形，其中胞體較透亮、細(xì)胞核圓，與髓腔內(nèi)的其它雜細(xì)胞如白細(xì)胞等共同存在。經(jīng)定期換液后，去除其中大部分的懸浮細(xì)胞，可得到純化BMSC(如圖1A)。第7－8天時(shí)，BMSC相互接觸可

圖2 兩組BMSC增殖的對(duì)比

2.4 DAPT對(duì)BMSC成骨分化的檢測(cè)，ALP定量測(cè)定結(jié)果:ALP定量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3，對(duì)照組與DAPT組ALP表達(dá)均在第7 天達(dá)到峰值(0.831 ±0.047;1.236±0.059)，第7天前兩組之間ALP表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)，兩組之間在第 7 天(t= －5.369)，第 9 天(t= －4.676)、第11 天(t= －3.389)ALP 表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(n=6，P＜0.01)(圖3)。

圖3 兩組ALP定量分析

3 討論

隨著我國(guó)逐漸步入老齡社會(huì)，原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥是老年人，尤其是絕經(jīng)后老年婦女的一種常見(jiàn)病、多發(fā)病，嚴(yán)重地威脅著老年人的身體健康。隨著我國(guó)人口的不斷老齡化和平均期望壽命增長(zhǎng)，骨質(zhì)疏松癥將成為嚴(yán)重危害中老年人群身心健康和生活質(zhì)量的疾病之一，隨之而來(lái)的骨質(zhì)疏松性骨折也給社會(huì)及家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)［7，8］。骨質(zhì)疏松的發(fā)生與破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的代謝失衡密切相關(guān)［9］，其中絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松屬于骨質(zhì)疏松的一種，絕經(jīng)后女性體內(nèi)雌激素的逐漸缺乏，而后者的減少導(dǎo)致了破骨細(xì)胞造成的骨吸收大于成骨細(xì)胞的骨形成。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥由于自身的特點(diǎn):全身性骨量普遍減少、骨的微結(jié)構(gòu)發(fā)生退行性變，骨的脆性增高及骨折危險(xiǎn)性增加［10，11］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)去除大鼠卵巢成功制作了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠動(dòng)物模型，并通過(guò)了骨密度檢測(cè)的驗(yàn)證。

在已發(fā)現(xiàn)的少數(shù)信號(hào)通路中，有少數(shù)的信號(hào)通路是用來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的命運(yùn)的，如細(xì)胞的增殖分化與死亡。Notch通路就是其中的一種。根據(jù)國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道，Notch通路是調(diào)控BMSC向成骨細(xì)胞的增殖和定向分化的關(guān)鍵通路之一［12］。Notch基因發(fā)現(xiàn)于一個(gè)世紀(jì)前，Notch的配體常常以跨膜蛋白的形式存在，當(dāng)Notch受體與配體結(jié)合后，活化的Notch受體從胞膜脫落下來(lái)后，可直接轉(zhuǎn)至核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子結(jié)合而激活靶基因，這種傳導(dǎo)非常的簡(jiǎn)單，并且不需要第二信使的傳導(dǎo);激活Notch可引發(fā)多種信號(hào)，多種調(diào)節(jié)因素通過(guò)不同機(jī)制調(diào)節(jié)Notch信號(hào)。因?yàn)镹otch信號(hào)通路的這種簡(jiǎn)單的跨膜傳遞信號(hào)途徑，具有了特異性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，基本避免其他信號(hào)的干擾。Notch經(jīng)過(guò)兩步蛋白酶水解過(guò)程，釋放出Notch的胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域NICD，其中介導(dǎo)這酶切過(guò)程的關(guān)鍵蛋白酶之一為γ分泌酶。據(jù)報(bào)道，Notch通路對(duì)于MSC細(xì)胞的成骨分化十分重要，有人發(fā)現(xiàn)在Prxl增強(qiáng)子控制下的Notch的過(guò)表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)間充質(zhì)前體細(xì)胞的增殖，抑制其分化。那么通過(guò)抑制Notch通路的激活是否能達(dá)到促進(jìn)BMSC向成骨細(xì)胞的分化呢?

DAPT作為Notch信號(hào)通路的阻斷劑，能夠特異地阻斷γ分泌酶的作用，從而抑制Notch信號(hào)通路的活化。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)DAPT的應(yīng)用，阻斷了Notch通路。通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，MTT法是檢測(cè)細(xì)胞增殖活力的一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的方法，其中活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中是MTT比色法的原理與關(guān)鍵，通過(guò)比色，對(duì)A值進(jìn)行分析，可反映細(xì)胞生長(zhǎng)和存活情況。在實(shí)驗(yàn)中我們觀察到與對(duì)照組相比，DAPT阻斷Notch通路后，BMSC的增殖受到了抑制。這與目前的相關(guān)研究結(jié)果是一致的，但其整體的生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組相似，這也說(shuō)明了在調(diào)控BMSC增殖的過(guò)程中應(yīng)該涉及到多條信號(hào)通路的共同作用。

在骨的發(fā)生、發(fā)育和修復(fù)與成骨細(xì)胞密切相關(guān)，因此成骨細(xì)胞也成為骨組織工程的關(guān)鍵細(xì)胞。ALP活性是成骨細(xì)胞分化的早期指標(biāo)，在體外鈣化中起關(guān)鍵性作用，反映了細(xì)胞的成骨活性。本研究發(fā)現(xiàn)在抑制Notch通路活化后，ALP活性實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組，BMSC向成骨細(xì)胞的定向分化是增強(qiáng)的。

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