丙氨瑞林對子宮內膜癌裸鼠移植瘤的生長及FHIT表達的影響

杜麗英 張三元

[摘要] 目的 觀察醋酸丙氨瑞林對子宮內膜癌裸鼠移植瘤生長的抑制作用及可能的作用機制。 方法 將HEC-1-B細胞注入裸鼠左前肢近腋窩處皮下，選24只雌性荷瘤裸鼠隨機分為4組，即低劑量組（18 μg/kg）、中劑量組（36 μg/kg）、高劑量組（72 μg/kg）和空白對照組（0 μg/kg），采取肌肉注射方式給藥4周。將瘤體完整取出，測量體積、繪制生長曲線、計算抑瘤率，并用免疫組織化學法檢測瘤組織中FHIT蛋白的表達。 結果 ①隨著醋酸丙氨瑞林濃度由低到高，癌細胞受抑制漸趨明顯，低、中、高劑量組抑瘤率分別為17.0%、24.1%、42.1%，且與對照組比較差異有統計學意義（P ＜ 0.05）。②免疫組織化學結果顯示，各干預組的FHIT蛋白表達水平較對照組明顯升高，且組間差異有統計學意義（P ＜ 0.05）。 結論 醋酸丙氨瑞林對子宮內膜癌皮下移植瘤生長有抑制作用，且呈劑量依賴關系，其機制可能與上調FHIT蛋白表達有關。

[關鍵詞] 子宮內膜癌；丙氨瑞林；移植瘤

[中圖分類號] R737.33[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-9701（2012）12-0006-03

子宮內膜癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，嚴重危害著女性的健康。近年來隨著對促性腺激素類似物GnRH-a研究的不斷深入及臨床工作者追求低毒高效安全的腫瘤內分泌治療方法熱情的不斷高漲，使其在治療子宮內膜癌方面越來越受到人們的青睞。GnRH-a是人工合成的促性腺激素，文獻報道[1，2]其對子宮內膜癌的治療已取得一定的效果。本研究通過不同劑量國產GnRH-a醋酸丙氨瑞林對裸鼠人子宮內膜癌移植瘤的生長及FHIT蛋白表達的影響，探討其對子宮內膜癌的治療作用及可能的機制，為GnRH-a在子宮內膜癌臨床治療方面提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人子宮內膜癌HEC-1-B細胞株，BALB/c雌性裸小鼠26只，醋酸丙氨瑞林，兔抗人FHIT多克隆抗體，免疫組織化學PV試劑盒。

1.2 細胞培養

將子宮內膜癌細胞株HEC-1-B培養于10%標準胎牛血清DMEM培養基中，溫度37℃，pH 7.2，相對飽和濕度為40%～60%，CO2體積分數為5%，當細胞達到70%～80%融合時，收集對數生長期的細胞制備成濃度為3.0×106/mL的單細胞懸液備用。

1.3 制備人子宮內膜癌裸鼠移植瘤模型及生長檢測

于裸鼠左前肢近腋窩處皮下注射子宮內膜癌細胞株HEC-1-B細胞懸液0.2 mL（約含6×106個細胞）后觀察：當瘤體直徑約0.3～0.5 cm時將瘤體最大和最小的兩只裸鼠舍去，剩余的隨機分成4組，分別給予18 μg/kg、36 μg/kg、72 μg/kg醋酸丙氨瑞林及生理鹽水背部肌肉注射，1次/d，共4周。每4天測量1次瘤體的長徑a和短徑b，計算其體積（mm3）=a×b2×0.52。實驗后計算抑瘤率（IR%）=[1-治療組平均腫瘤體積/對照組平均腫瘤體積]×100%。抑瘤率＞15%為藥敏陽性。

1.4 免疫組織化學法檢測FHIT蛋白在移植瘤中的表達

將瘤體標本經10%甲醛固定、石蠟包埋，制成4 μm左右切片，免疫組化染色后脫蠟浸水；熱修復2 min，3% H2O2室溫孵育滅活內源性過氧化氫酶；滴加兔抗人FHIT多克隆抗體（1∶75），4℃濕盒過夜；加二抗，PBS浸洗后DAB顯色，最后蘇木素襯染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、顯微鏡觀察。陰性對照組用PBS代替一抗。結果判斷標準：免疫組織染色后，FHIT蛋白在移植瘤中的陽性表達為棕黃色或棕褐色顆粒，主要定位于胞漿內，少部分定位于胞核。每張切片隨機選取5個不連續、不重復的高倍視野（×400），用病理圖像分析軟件分析各切片陽性產物的灰度值，取均數后行統計學處理。

1.5 統計學處理

數據采用SPSS 16.0軟件行統計學處理，計量數據以（x±s）表示，采用單因素方差分析及LSD-t檢驗，P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 裸鼠移植瘤的形成及受不同干預后瘤體變化情況

接種子宮內膜癌細胞懸液后，局部稍發紅、腫脹，后出現圓形或橢圓形的瘤體逐漸增大，且邊界清楚，質由軟變硬，活動較好。裸鼠逐漸出現消瘦，反應力、活動力下降等癥狀。對照組腫瘤體積增長較快，其余各組均受到不同程度的抑制，而且隨著劑量的增加移植瘤生長明顯減慢。

2.2 繪制體積變化曲線（圖1）

可見各組腫瘤生長曲線斜率不同，斜率越小，腫瘤生長速度受抑制越明顯，各組之間差異有統計學意義（P ＜ 0.05）。同時可以看出干預組較對照組瘤體積均較小，差異有統計學意義（P ＜ 0.05），各組瘤體也隨劑量增加而明顯減小，且呈劑量依賴性。低、中、高劑量干預組的抑瘤率分別為17.0%、24.1%、42.1%，且組與組之間差異有統計學意義（P ＜ 0.05）。見表1。

2.3 醋酸丙氨瑞林對子宮內膜癌移植瘤中FHIT蛋白表達的影響

隨著丙氨瑞林劑量的增加，FHIT蛋白陽性染色逐漸加深。對各切片陽性產物進行灰度值分析（表2）發現：與對照組比較，各治療組中FHIT蛋白表達水平灰度值均明顯降低（P ＜ 0.05），且不同劑量組間差異也有統計學意義（P ＜ 0.05）。

3 討論

近年來，隨著對GnRH及其類似物研究的盛行，以及內分泌治療在治療腫瘤中的應用越來越廣泛，使GnRH及其類似物在治療子宮內膜癌方面也越來越受到人們的關注。GnRH-a的作用機制可能是直接作用于腫瘤，也可能通過抑制細胞增殖、促進細胞凋亡等間接起到抗腫瘤的作用，但其具體分子機制仍不十分清楚。近來有很多關于用GnRH-a成功治療復發或進展期子宮內膜癌的報道[3]，且沒有臨床數據顯示有副作用。Wang CB等[4]隨訪的年輕子宮內膜癌患者中，應用亮丙瑞林聯合甲地孕酮、他莫西芬的緩解率較不聯合亮丙瑞林治療的緩解率高。此外，也有研究報道，晚期子宮內膜癌經GnRH-a治療，可以得到很好的緩解，且耐受性好、毒性低。FHIT（脆性組氨酸三聯體基因）蛋白是新近發現的抑癌基因[5]，屬于組氨酸三聯體蛋白家族，具有抑癌活性，一方面可以促進微管的裝配，另一方面抑制細胞周期、促進細胞凋亡，從而抑制腫瘤生長。FHIT有1個專門與微球蛋白結合的位點，可促使微管集中，限制微管動態活動或干擾微管分散而阻止細胞的有絲分裂過程，抑制細胞過度增殖，使細胞受阻于增殖周期的S期，并激活Caspase28、Caspase29，引起Caspase酶介導的凋亡級聯反應[6]。Su TH及Ozaki K等[7，8]都證明了FHIT 基因的失活與子宮內膜腺癌的發生發展密切相關。

本研究選用免疫缺陷的裸鼠接種HEC-1B細胞株進行造模以觀察醋酸丙氨瑞林的抗子宮內膜癌作用。結果發現，子宮內膜癌皮下移植瘤的生長受到丙氨瑞林的抑制，呈劑量依賴性。劑量越大，腫瘤生長受抑制程度越深。免疫組化法對胞質中的FHIT蛋白活性檢測顯示隨著醋酸丙氨瑞林劑量的升高，FHIT的蛋白活性表達升高，顯示醋酸丙氨瑞林抑制子宮內膜癌移植瘤生長的作用機制可能通過上調FHIT蛋白的活性，激活Caspase28、Caspase29，引起Caspase酶介導的凋亡級聯反應，誘導子宮內膜癌細胞凋亡，發揮抗腫瘤作用。

綜上所述，GnRH及其類似物在一定程度上可以抑制子宮內膜癌的生長，其可能作為子宮內膜癌內分泌治療的一種有效藥物來應用，因此展示在腫瘤患者面前的將是一個廣闊的前景。

[參考文獻]

[1]Gallagher CJ，Oliver RT，Oram DH，et al. A new treatment for endometrial cancer with gonadotrophin releasing-hormone[J]. Br J Obstet Gynaecol，1991，98（10）：1037-1041.

[2]張玉泉，曹斌融，周先榮，等. 丙氨瑞林治療子宮內膜癌后性激素及有絲分裂指數的變化[J]. 新藥與臨床，1996，15（4）：1942-1961.

[3]Grundker C，Gunthert AR，Westphalen S，et al. Biology of the gonadotrophin-releasing hormone system in gynecological cancers[J]. Eur J Endocrinol，2002，146（1）：1-14.

[4]Wang CB，Wang CJ，Huang HJ，et al. Fertility-preserving treatment in young patients with endometrial adenocarcinoma[J]. Cancer，2002，94（8）：2192-2198.

[5]Segawa T，Sasagawa T，Saijoh K，et al． Clinicopathological significance of fragile histidine triad transcription protein expression in endometrial carcinomas[J]. Clin Cancer Res，2000，6（6）：2341-2348.

[6]Ishii H，Dumon KR，Vecchione A，et al. Effect of adenoviral transduction of the fragile histidine trad gene into esophageal cancer cells[J]. Cancer Res，2001，61（4）：1578-1584.

[7]Su TH，Wang JC，Tseng HH，et al. Analysis of FHIT transcripts in cervical and endometrial cancers[J]. Int J Cancer，1998，76（2）：216-222.

[8]Ozaki K，Enomoto T，Yoshino K，et al. FHIT alterations in endometrial carcinoma and hyperplasia[J]. Int J Cancer，2000，85（3）：306-312.

（收稿日期：2012-02-02）