多重熒光PCR鑒別診斷豬瘟病毒和非洲豬瘟病毒

陳靜靜 羅寶正 沙才華(等)

摘要：為了建立一種快速、靈敏、特異的能夠同時檢測豬瘟病毒和非洲豬瘟病毒的多重熒光ＰＣＲ方法，根據ＧｅｎＢａｎｋ中公布的豬瘟病毒基因序列，設計一套特異性的引物和探針，對豬瘟病料提取ＲＮＡ，經ＲＴ－ＰＣＲ擴增后將產物回收，克隆至ｐＭＤ１８－Ｔ構建ｐＭＤ１８－Ｔ－ＣＳＦＶ陽性質粒；非洲豬瘟的目的片段序列采用化學合成，構建ｐＭＤ１８－Ｔ－ＡＳＦＶ陽性質粒。以兩種陽性質粒為模板對建立的多重熒光ＰＣＲ方法做特異性、靈敏度和重復性試驗，結果表明該方法可以將豬瘟病毒和非洲豬瘟病毒同口蹄疫病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬水泡病病毒、豬圓環病毒２型區分開，靈敏度可以達到１０拷貝的數量級，而且方法穩定。對２份已知豬瘟陽性血清樣品和１２０份豬內臟、豬鼻腔拭子及血清樣品檢測后，發現對已知陽性樣品的檢測結果符合預期目標，未知樣品檢出豬瘟病毒３份陽性，未檢出非洲豬瘟病毒陽性。

關鍵詞：豬瘟病毒；非洲豬瘟病毒；多重熒光ＰＣＲ；檢測

中圖分類號：Ｓ８５５．３ 文獻標識碼：B 文章編號：１００７－２７３Ｘ（２０12）02-0004-03

豬瘟（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ sｗｉｎｅ fｅｖｅｒ，ＣＳＦ）又稱豬霍亂（Ｈｏｇ cｈｏｌｅｒａ，ＨＣ），是由豬瘟病毒（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ sｗｉｎｅ fｅｖｅｒ vｉｒｕｓ，ＣＳＦＶ）引起的一種高度接觸性傳染病，世界動物衛生組織（ＯＩＥ）將其列為必須通報的動物傳染病。１９世紀３０年代，該病在美國俄亥俄州首次報道，后來在亞洲、美洲、歐洲和非洲均有不同程度的流行。目前，雖然世界上有些國家宣布消滅了豬瘟，但是在亞洲、歐洲、非洲及南美洲的墨西哥、古巴等國家，豬瘟仍然存在［１，２］。由于該病暴發時會對養豬業造成嚴重的經濟損失，而且在國際貿易中宣布無豬瘟國家往往會出臺相關貿易政策限制豬瘟疫區國家豬肉和種豬的進口，所以對于很多豬瘟疫區的國家而言，早期檢測豬瘟病毒對于豬瘟的防控和根除顯得尤為重要。

非洲豬瘟（Ａｆｒｉｃａｎ sｗｉｎｅ fｅｖｅｒ，ＡＳＦ）是由非洲豬瘟病毒（Ａｆｒｉｃａｎ sｗｉｎｅ fｅｖｅｒ vｉｒｕｓ，ＡＳＦＶ）引起的一種豬的烈性、高度接觸性傳染病，在ＯＩＥ中也是被列為Ａ類動物傳染病。雖然非洲豬瘟屬于非洲本土病，但是從１９２１年肯尼亞第一次報道后到目前已經有４９個國家報道過非洲豬瘟疫情［３］，我國迄今雖然沒有非洲豬瘟的發病報道，但由于與非洲豬瘟疫區國家有相關貿易活動所以存在該病潛入的風險。我國農業部在２００８年發布的《一、二、三類動物疫病病種名錄》中將豬瘟和非洲豬瘟都列入了一類動物疫病。

豬瘟和非洲豬瘟是豬的兩種重要病毒病，雖然病原學分類不同，但是感染后臨床癥狀及病理變化差別很小，單純靠臨床診斷和剖檢變化不能區分兩種病，只能依據實驗室診斷才能定性。目前針對于豬瘟和非洲豬瘟的實驗室診斷主要依據病原學、血清學及核酸檢測技術。病原學和血清學方法存在一定的局限性，近年來在ＰＣＲ基礎上發展起來的熒光ＰＣＲ技術以其直觀、快速、靈敏、特異及污染性小等優點已廣泛應用于動物疫病檢測方面。本研究擬建立可同時檢測豬瘟和非洲豬瘟的多重熒光ＰＣＲ方法，以期能在豬瘟和非洲豬瘟的疫情監測及綜合防控中發揮獨特作用。

１材料與方法

１．１材料

毒株：病毒均為疫苗毒。豬瘟疫苗，廣東永順生物制藥有限公司；口蹄疫疫苗，中牧集團股份有限公司；豬傳染性胃腸炎疫苗，哈爾濱獸醫研究所；豬呼吸與繁殖障礙綜合征疫苗，南京科農生物技術研究所；豬水泡病病毒ＲＮＡ和豬圓環病毒２型重組質粒為本實驗室保存。

試劑和儀器：ＤＮＡ／ＲＮＡ磁珠提取試劑盒，購自深圳易瑞生物技術有限公司；Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ試劑盒，ＤＮＡ膠回收試劑盒，質粒提取試劑盒，ＤＬ ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋ，ｐＭＤ１８－Ｔ購自寶生物工程（大連）有限公司；ＡＢＩ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ，美國Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ。

１．２方法

１．２．１病毒ＲＮＡ提取采用ＤＮＡ／ＲＮＡ磁珠提取試劑盒，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行，分別提取豬瘟病毒、口蹄疫病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒的ＲＮＡ，將提取的ＲＮＡ于－２０℃保存，備用。

１．２．２引物和探針的設計合成在ＧｅｎＢａｎｋ上下載多條豬瘟病毒的全基因組序列，利用ＤＮＡＳｔａｒ進行序列比對后在保守區域５ＵＴＲ內設計一對引物和探針。非洲豬瘟的引物和探針采用ＯＩＥ公布的參考序列，引物探針由上海超世生物科技公司合成。序列見表１。

１．２．３豬瘟ＲＴ－ＰＣＲ使用引物對ＣＳＦＶ８１－Ｆ和ＣＳＦＶ８１－Ｒ以１．２．１中所提豬瘟病毒ＲＮＡ為模板進行ＲＴ－ＰＣＲ擴增，獲取克隆用目的片段。使用ＴａＫａＲａ一步法試劑盒，體系如下：２×Ｂｕｆｆｅｒ １２．５ μＬ、ＣＳＦＶ８１－Ｆ（１０ μｍｏｌ／Ｌ）１．０ μＬ、ＣＳＦＶ８１－Ｒ（１０ μｍｏｌ／Ｌ）１．０ μＬ、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ １ Ｓｔｅｐ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ １．０ μＬ、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏ ７．０ μＬ、ＲＮＡ ２．５ μＬ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ＜１．０ μｇ），共２５ μＬ。反應程序：５０℃ ３０ ｍｉｎ，９５ ℃ ２ ｍｉｎ，９５ ℃ ３０ ｓ，５５ ℃ ３０ ｓ，７２ ℃ ４０ ｓ，７２ ℃ ７ ｍｉｎ，３５個循環，反應結束后用２．０％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

１．２．４陽性質粒的制備將１．２．３中獲得的豬瘟ＲＴ－ＰＣＲ產物目的片段膠回收，純化后克隆至ｐＭＤ１８－Ｔ載體，轉化至大腸桿菌感受態ＪＭ１０９，對培養后的克隆菌提取質粒。將重組質粒送至廣州英駿公司測序，鑒定后即成功構建可用作豬瘟陽性對照的重組質粒ｐＭＤ１８－Ｔ－ＣＳＦＶ。由于非洲豬瘟沒有病料，將目的片段序列由寶生物工程（大連）有限公司合成，然后克隆至ｐＭＤ１８－Ｔ構建ｐＭＤ１８－Ｔ－ＡＳＦＶ重組質粒。

１．２．５引物、探針濃度的優化使用ＴａＫａＲａ一步法試劑盒，體系為３５ μＬ，分別調整豬瘟１０ ｐｍｏｌ／μＬ的引物探針各１．０、１．２、１．５、１．８、２．０ μＬ與非洲豬瘟１０ ｐｍｏｌ／μＬ的引物探針各２．０、１．８、１．５、１．２、１．０ μＬ相混合，通過擴增曲線的Ｃｔ值和熒光高度直觀看出最佳引物和探針濃度組合。

１．２．６特異性試驗按照１．２．５中優化的豬瘟和非洲豬瘟的最佳引物和探針濃度組合配制多個熒光ＰＣＲ反應體系，分別加入豬瘟和非洲豬瘟、口蹄疫、豬傳染性胃腸炎、豬繁殖與呼吸綜合征、豬水泡病及豬圓環病毒２型的模板進行擴增。

１．２．７靈敏度試驗將１．２．４中制備的重組質粒ｐＭＤ１８－Ｔ－ＣＳＦＶ和ｐＭＤ１８－Ｔ－ＡＳＦＶ（濃度為1.2×1010ｃｏｐｉｅｓ／μＬ）梯度稀釋為１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１、１００ｃｏｐｉｅｓ／μＬ，分別以每個梯度質粒為模板，在熒光ＰＣＲ儀上反應。

１．２．８穩定性試驗在多重ＰＣＲ反應體系中加入豬瘟１０５拷貝數的梯度和非洲豬瘟１０７拷貝數的梯度模板，做２０次重復。間隔３０ｄ再以此反應體系和梯度模板做２０次重復。對兩次重復試驗的Ｃｔ值用ＳＰＳＳ １３．０分析穩定性。

１．２．９臨床樣品檢測將本研究中所建立的多重熒光ＰＣＲ方法對２份本實驗室保存的已知豬瘟陽性血清和１２０份豬內臟、豬鼻腔拭子及血清樣品進行檢測。

２結果

２．１豬瘟ＲＴ－ＰＣＲ擴增結果

由圖１可看出，ＲＴ－ＰＣＲ擴增結果與預期片段大小基本一致。

２．２重組質粒的PCR擴增結果

重組質粒ｐＭＤ１８－Ｔ－ＣＳＦＶ和ｐＭＤ１８－Ｔ－ＡＳＦＶ的插入片段測序結果在ＮＣＢＩ經ＢＬＡＳＴ比對后與ＧｅｎＢａｎｋ中序列同源性較高。由圖２可以看出，經ＰＣＲ擴增的片段大小在預期目標內。

２．３引物、探針濃度的優化結果

通過在熒光ＰＣＲ儀上擴增曲線的Ｃｔ值和熒光高度看，使用１０ ｐｍｏｌ／μＬ的引物、探針各１．５ μＬ的時，豬瘟病毒和非洲豬瘟病毒都有良好的擴增曲線。

２．4特異性試驗結果

由圖３可以看出，本研究中的多重熒光ＰＣＲ反應體系只針對豬瘟和非洲豬瘟有特異性擴增，其他對照病毒無擴增曲線。

２．5靈敏度試驗結果

由圖４可以看出，本研究所建立的多重熒光ＰＣＲ方法可以檢測到最低１０1ｃｏｐｉｅｓ／μＬ的模板濃度。

２．６穩定性試驗結果

豬瘟的批次內變異系數分別為２．５４％、１．７０％，批次間為２．１３％，兩次結果無顯著差異（Ｐ＞０．０５）；非洲豬瘟的批次內變異系數分別為１．３４％、１．３０％，批次間為１．５６％，兩次結果無顯著差異（Ｐ＞０．０５），說明該實驗方法的穩定性良好。

２．７臨床樣品檢測結果

２份豬瘟陽性血清檢測結果全部為陽性（Ｃｔ＜３０），１２０份鼻腔拭子、豬內臟和血清中出現３份豬瘟陽性，陽性率為２．５％，未發現有非洲豬瘟陽性。

３討論

我國是豬瘟多發國家，目前雖然沒有非洲豬瘟的報道，但是建立相關實驗方法對該病的監測卻是不可或缺的。對于豬瘟和非洲豬瘟的診斷方法主要包括ＦＡＴ、ＥＬＩＳＡ，動物接種試驗及核酸檢測技術［４，５］。ＦＡＴ和ＥＬＩＳＡ方法對病料要求要盡可能新鮮，否則會降低病毒鑒定的可能性，而且當豬感染引起急性癥狀時短時間內機體往往難以產生足夠的抗體，這樣就可能會誤判。動物接種試驗時間較長，花費較大而且會引起動物福利問題，所以ＯＩＥ不推薦使用該法。ＴａｑＭａｎ探針熒光定量ＰＣＲ是通過檢測反應體系中熒光強度的動態變化來定性、定量分析的一種實時熒光檢測分析方法［６］，具有靈敏度高、特異性強及整個反應只需一次加樣且污染性小的優點。

本研究中豬瘟和非洲豬瘟引物和探針的設計選擇在各自基因高度保守區域內，最大程度上降低不同毒株之間的特異性，避免病原的漏檢。由于建立的是多重熒光ＰＣＲ，所以在設計引物探針時還要避免兩種病原引物探針間不能產生二聚體和發卡結構。同時，對豬瘟和非洲豬瘟的引物和探針最佳濃度比例做了優化，確保兩套引物探針在同一個體系中發揮最佳作用。在特異性試驗中，能夠將豬瘟和非洲豬瘟同口蹄疫病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬水泡病病毒及圓環病毒２型區分開，說明本研究所建立的多重熒光ＰＣＲ方法可以將豬瘟病毒和非洲豬瘟病毒同豬類易感的其他病毒區分開。李維彬等［７］在ＴａｑＭａｎ探針檢測非洲豬瘟方法中報道該方法可以檢測到１００個拷貝數，重復試驗中變異系數在２．１３％~３．６２％之間。張倩［８］在非洲豬瘟病毒和古典豬瘟病毒雙重熒光ＰＣＲ檢測方法中報道該研究可以檢測到非洲豬瘟的１０個拷貝數、豬瘟的１００個拷貝數。本實驗中建立的方法對豬瘟病毒和非洲豬瘟病毒的檢測底限都可以達到１０拷貝數的數量級，而且方法穩定，變異系數均小于３％。另外，Ｒｉｓａｔｔｉ等［９］報道，熒光ＰＣＲ方法能夠于動物出現臨床癥狀前３～５ｄ檢測到豬瘟病毒，而且鼻腔拭子和扁桃體拭子的檢出時間也早于血液樣品。可見，采用正確部位的臨床樣品也是早期檢測豬瘟病毒的關鍵。總之，本研究建立了可同時檢測豬瘟和非洲豬瘟的多重熒光ＰＣＲ方法，靈敏度高，特異性強，有望在豬瘟和非洲豬瘟的病原普查、早期診斷以及防控措施中發揮作用。

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