喉癌組織微淋巴管密度和微血管密度的定量測定及臨床意義

張亞軍　盛成　岳利華　蔣志毅

[摘要] 目的 探討不同喉部病變組織微淋巴管和微血管的密度及臨床意義。 方法 選擇喉鱗狀細(xì)胞癌40例及喉鱗狀上皮不典型增生和成人喉乳頭狀瘤患者各20例病變標(biāo)本，分別進(jìn)行微淋巴管及微血管染色。 結(jié)果 喉鱗狀細(xì)胞癌、喉鱗狀上皮不典型增生和喉乳頭狀瘤組織中LVD及MVD值之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.01）。高分化癌組織LVD和MVD顯著高于中、低分化癌組織，TNM Ⅲ～Ⅳ期癌組織LVD和MVD顯著高于Ⅰ～Ⅱ期癌組織，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織LVD和MVD顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織（P < 0.01），聲門上型癌組織MVD顯著高于聲門型癌組織（P < 0.05）。LVD、MVD及TNM分期是影響喉鱗狀細(xì)胞癌患者生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P < 0.05）。 結(jié)論 喉癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移與微淋巴管及微血管的密度有關(guān)，兩者都是喉癌預(yù)后的負(fù)性因子，定量測定可作為喉癌預(yù)后的指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 喉腫瘤；鱗狀細(xì)胞癌；微血管密度；微淋巴管密度

[中圖分類號] R739.65[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B[文章編號] 1673—9701（2012）24—0030—03

The quantitative determination and its clinical significance of lymphatic vessel density and microvessel density in laryngeal carcinoma

ZHANG Yajun SHENG Cheng YUE Lihua JIANG Zhiyi

Department of Otolaryngology， First Hospital of Jiaxing City in Zhejiang Province， Jiaxing 314000， China

[Abstract] Objective To investigate the lymphatic vesseldensity （LVD） and microvessel density （MVD） in different laryngeal lesions and the clinical significance of them. Methods Quantitative determination of lymphatic vessel density and microvessel density in laryngeal cancer （n = 40）， laryngeal squamous dysplasia （n = 20） and laryngeal papilloma in adults （n = 20） were done. Results Laryngeal squamous cell carcinoma， laryngeal squamous dysplasia and laryngeal papilloma tissue differences between LVD and MVD were statistically significant （P < 0.01）. LVD and MVD of poorly—differentiated cancer tissue were significantly higher than in well—differentiated cancer tissue； LVD and MVD of TNM Ⅲ—Ⅳ of cancer tissue were significantly higher than the TNMⅠ—Ⅱ cancer tissues， LVD and MVD of with lymph node metastasis in cancer tissues were significantly higher than those without lymph node metastasis in cancer tissues （P < 0.01）； MVD of supraglottic cancer were significantly higher than the glottic cancer group （P < 0.05）. LVD， MVD and TNM stage were the independent risk factors for laryngeal squamous cell carcinoma of the survival time of patients （P < 0.05）. Conclusion The development and transferation of the laryngeal tumor is related to micro lymphatic and capillary density， both are laryngeal negative prognostic factors， quantitative determination of the index can be as a predictor of laryngeal tumor prognosis.

[Key words] Laryngeal tumors； Squamous cell carcinoma； Microvessel density； Lymphatic vessel density

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，鱗狀細(xì)胞癌是主要的類型，其發(fā)生與多種因素有關(guān)。腫瘤組織生長迅速，代謝旺盛，離不開血管系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)的支持，而腫瘤內(nèi)的微淋巴管和微血管也被證明與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)。為進(jìn)一步了解喉癌組織中微淋巴管和微血管分布與喉癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，指導(dǎo)臨床對喉癌的診斷和治療，本研究對喉鱗狀細(xì)胞癌組織中微淋巴管密度（lymphatic vessel density，LVD）和微血管密度（microvessel density，MVD）進(jìn)行定量測定與分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2008年1月～2011年6月在我院行喉部分或全切除術(shù)治療的原發(fā)性喉癌患者的喉癌病理組織標(biāo)本40例，經(jīng)病理證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌，男31例，女9例，年齡43～76歲，平均（61.56±10.27）歲，均未接受任何放療、化療，聲門上型28例，聲門型12例；組織學(xué)分級按WHO1990年標(biāo)準(zhǔn)：高分化鱗癌15例，中分化鱗癌13例，低分化鱗癌12例；臨床分期按國際抗癌協(xié)會（UICC）2002年版TNM標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期10例、Ⅱ期13例、Ⅲ期9例、Ⅳ期8例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例。另選擇喉鱗狀上皮不典型增生和成人喉乳頭狀瘤患者病變標(biāo)本各20例，三組患者的性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

1.2 試劑

鼠抗人CD105單克隆抗體、二甲胂酸鈉、二甲基甲酰胺、左旋咪唑、萘酚AS—MX磷酸鈉、腺苷—5—磷酸鈉、固藍(lán)BB鹽即用型免疫組化（SP）檢測試劑盒及DAB顯色劑均為美國Sigma公司產(chǎn)品，購自上海工碩生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

所有標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋，連續(xù)切片，厚4 μm，脫蠟、水化、過氧化氫預(yù)孵、漂洗。取同一標(biāo)本相鄰切片分別采用酶組化染色法以腺苷—5—磷酸鈉進(jìn)行淋巴管染色，鏈霉素親和素—生物素—過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)（SABC）進(jìn)行CD105標(biāo)記血管染色。按試劑盒說明書操作進(jìn)行。PBS替代一抗作為陰性對照，試劑公司提供陽性樣本作為陽性對照。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn)

腺苷—5—磷酸鈉標(biāo)記于微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，陽性呈棕黃色。CD105標(biāo)記于微血管內(nèi)皮細(xì)胞，陽性呈棕黃色。LVD和MVD計(jì)數(shù)方法均為：于40倍光鏡下尋找全部視野下淋巴管或血管高密度區(qū)域，再于400倍光鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野內(nèi)微淋巴管/微血管數(shù)，求平均數(shù)作為該標(biāo)本LVD或MVD。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)或方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，無進(jìn)展生存曲線采用Kaplan—Meier法繪制，采用Log—rank法檢驗(yàn)，采用COX模型進(jìn)行多因素分析，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同喉部病變組織中微淋巴管和微血管染色表達(dá)比較

喉鱗狀細(xì)胞癌、喉鱗狀上皮不典型增生和喉乳頭狀瘤組織中LVD及MVD值之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），喉鱗狀細(xì)胞癌組織LVD及MVD值均顯著高于喉鱗狀上皮不典型增生和喉乳頭狀瘤組織，喉鱗狀上皮不典型增生組織中LVD及MVD值介于喉鱗狀細(xì)胞癌和喉乳頭狀瘤組織之間。

2.2 LVD及MVD與喉鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系

低分化癌組織LVD顯著高于中、高分化癌組織，TNM Ⅲ～Ⅳ期癌組織LVD顯著高于Ⅰ～Ⅱ期癌組織，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織LVD顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織（P < 0.01），與年齡、性別及腫瘤位置無關(guān)（P > 0.05）。低分化癌組織MVD顯著高于中、高分化癌組織，TNM Ⅲ～Ⅳ期癌組織MVD顯著高于Ⅰ～Ⅱ期癌組織，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織MVD顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織（P < 0.01），聲門上型癌組織MVD顯著高于聲門型癌組織（P < 0.05）。見表2。

2.3 LVD及MVD與喉鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系

40例喉鱗狀細(xì)胞癌患者根據(jù)LVD和MVD均值分為：高于均值為HLVD組和HMVD組，低于均值為LLVD組和LMVD組，HLVD組和LLVD組分別為24例和16例，HMVD組和LMVD組分別為22例和18例，根據(jù)術(shù)后隨訪結(jié)果，隨訪時(shí)間（31.48±10.57）個(gè)月，HLVD組和LLVD組中位無進(jìn)展生存期分別為22.38個(gè)月、30.53個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.396，P < 0.05）；HMVD組和LMVD組中位無進(jìn)展生存期分別為23.67個(gè)月、31.49個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.094，P < 0.05）。

2.4 喉鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后危險(xiǎn)因素分析

對年齡、性別、腫瘤部位、LVD、MVD、組織學(xué)分級、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移帶入COX模型進(jìn)行多因素生存分析，LVD、MVD及TNM分期是影響喉鱗狀細(xì)胞癌患者生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P < 0.05），暴露與非暴露相對危險(xiǎn)度比（RR）以LVD最高。

3 討論

腫瘤組織的血管系統(tǒng)是腫瘤的生長、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)基礎(chǔ)，近年來的研究均證明腫瘤組織中存在大量的新生血管，并受到如血管內(nèi)皮生長因子—C（VEGF—C）、缺氧誘導(dǎo)因子—1（HIF—1）、肝細(xì)胞生長因子（HGF）、內(nèi)皮素—1（ET—1）等多種生長因子的調(diào)控。相關(guān)的研究也是近幾年腫瘤研究的熱點(diǎn)，MVD計(jì)數(shù)是目前定量測定腫瘤組織內(nèi)新生毛細(xì)血管的主要方法。組織細(xì)胞異常增殖是惡性變的基礎(chǔ)，成人喉乳頭狀瘤是喉部的良性病變，但隨著復(fù)發(fā)次數(shù)的增多，人乳頭狀瘤感染的組織細(xì)胞則可能出現(xiàn)異常增殖，則出現(xiàn)惡性變的可能；喉鱗狀上皮不典型增生則已經(jīng)出現(xiàn)異常增殖，是喉鱗狀細(xì)胞癌的癌前病變。本研究將兩者與喉鱗狀細(xì)胞癌組織中MVD進(jìn)行比較，結(jié)果三者組織中MVD呈現(xiàn)隨病變惡性程度增加而升高的趨勢，說明新生的微血管是喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生和進(jìn)展的重要因素，異常增生甚至惡性變的組織細(xì)胞對營養(yǎng)的需求量顯著高于正常組織或良性細(xì)胞，通過調(diào)高調(diào)控血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤內(nèi)部微血管的生成。

腫瘤組織內(nèi)新生淋巴管的存在與否仍存在爭議，但目前許多的研究證實(shí)腫瘤內(nèi)有新生的微淋巴管，并且多分布于腫瘤組織的邊緣，且管壁結(jié)構(gòu)不完整，瘤內(nèi)密度則較小，與本次研究觀察到的情況相似。這說明腫瘤內(nèi)存在新生的淋巴管，由于腫瘤邊緣細(xì)胞活性增殖程度最高，代謝旺盛，因而在腫瘤的邊緣分布密度更高，并且由于管壁結(jié)構(gòu)的不完整，通透性增加，更有利于腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散，并隨瘤內(nèi)微淋巴管到達(dá)瘤外組織中淋巴管及淋巴結(jié)形成轉(zhuǎn)移。微淋巴管促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的觀點(diǎn)仍存在一定爭議，某些惡性腫瘤內(nèi)部缺乏瘤內(nèi)淋巴管。也有些研究表明，VEGF—C不僅能夠促進(jìn)微血管的生成，對微淋巴管生成也有調(diào)控作用，并與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。本研究結(jié)果顯示，3種喉部病變組織中均存在微淋巴管，且LVD也隨著病變惡性程度的增加而升高，說明LVD與MVD在喉鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展過程中有相似的存在意義。

同時(shí)，本研究將LVD和MVD與喉癌臨床特征的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，兩者主要與腫瘤本身組織學(xué)分級、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且隨組織分化程度的降低及TNM分期的增加而升高，說明LVD、MVD與喉鱗狀細(xì)胞癌的惡性程度和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而惡性程度和轉(zhuǎn)移則是直接影響患者生存時(shí)間的關(guān)鍵。本研究將喉鱗狀細(xì)胞癌患者按LVD和MVD均數(shù)進(jìn)行分組，并對比各組在隨訪觀察時(shí)間內(nèi)的中位無進(jìn)展生存期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HLVD和HMVD組患者中位無進(jìn)展生存期均顯著少于LLVD和LMVD組患者，說明高密度的瘤內(nèi)微淋巴管和微血管對喉鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后有顯著的負(fù)性作用。通過COX多因素生存分析，證明LVD和MVD是喉鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的負(fù)性因子，TNM分期也是影響喉鱗狀細(xì)胞癌的危險(xiǎn)因素，而TNM分期越高腫瘤侵襲性越強(qiáng)，轉(zhuǎn)移的可能性大，正與LVD和MVD在腫瘤內(nèi)尤其是邊緣高密度分布有關(guān)。

綜上所述，喉癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移與微淋巴管及微血管的密度有關(guān)，兩者都是喉癌預(yù)后的負(fù)性因子，定量測定可作為喉癌預(yù)后的指標(biāo)。

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（收稿日期：2012—03—30）