限制性應激在實驗性牙周炎牙槽骨吸收中的作用

田劍敏　程美萍　張迪亞

[摘要] 目的 通過建立大鼠在限制性應激條件下實驗性牙周炎動物模型，探討限制性應激在實驗性牙周炎發展過程中的作用。 方法 48只雄性SD大鼠用0.012 mm不銹鋼絲線結扎左上頜第一磨牙后，隨機分為兩組，一組為應激組（給予限制性應激），另一組為非應激組（單純結扎）。每組大鼠分別在施加應激后第2、3、4、5周隨機各取6只處死，檢測牙齦指數、應激指標促腎上腺皮質激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）和皮質酮激素（corticosterone，CORT）在血清中的含量以及牙槽骨喪失程度（attachment loss，AL）。應用SPSS 10.0軟件進行統計分析。 結果 大鼠結扎后的左上頜第一磨牙牙齦指數均高于未結扎的右上頜第一磨牙，差異有統計學意義（P < 0.01）；應激組ACTH和CORT含量均高于非應激組（P < 0.01）；應激組結扎區AL明顯高于非應激組，差異有統計學意義（P < 0.01）；應激組前4周AL與時間呈正比，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 應激可以加重牙槽骨的吸收，并且隨著應激時間的增加，牙槽骨吸收的程度也會有所增加。

[關鍵詞] 限制性應激；牙周炎；牙槽骨喪失；促腎上腺皮質激素；皮質酮激素

[中圖分類號] R781.4[文獻標識碼] A[文章編號] 1673—9701（2012）24—0017—03

Effect of restraint stress on the progression of alveolar bone resorption in experimental periodontitis

TIAN Jianmin1 CHENG Meiping2 ZHANG Diya3

1.Department of Stomatology，Changxing County People''s Hospital in Zhejiang Province，Changxing 313100，China；2.Department of Stomatology，Dongyang City People''s Hospital in Zhejiang Province，Dongyang 322100，China；3.Department of Stomatology，the Affiliated Second Hospital of Medicine College in Zhejiang University，Hangzhou 310009，China

[Abstract] Objective To discuss the effect of restraint stress on the development and progression of experimental periodontitis，through the establishment of experimental periodontitis animal models under restraint stress condition. Methods Forty—eight male SD rats were selected with stainless steel wire （0.012 mm） ligating the left maxillary first molar and they were randomly divided into two groups：stress group （the rats were treated with restraint stress and ligation） and control group（the rats were treated with simple ligation）. Six rats were randomly selected and killed from each of group after stress was applied for 2，3，4，5 weeks. The related gingival index （GI）， the levels of adrenocorticotropic hormone （ACTH） and corticosterone （CORT） in serum， and the degree of attachment loss were tested. Statistical analysis was carried on by using the software of SPSS 10.0. Results The GI in rats left maxillary first molar ligating with the stainless steel wire were significantly higher than the right maxillary first molar without ligation （P < 0.01）； the contents of ACTH and CORT， the AL in stress group were significantly higher than the control group， there were all significant differences （P < 0.01）. The AL of the stress group in the first four weeks was proportional to the time， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Restraint stress can increase the absorption of alveolar bone，and with the stress time increases，the degree of alveolar bone loss will increase.

[Key words] Restraint stress； Periodontitis； Attachment loss； Adrenocorticotropic hormone； Corticosterone

牙周炎（periodontitis）是人類最常見的口腔感染性疾病之一，是造成牙槽骨吸收、牙松動脫落的主要原因，對口腔組織的健康有很大的危害。大量研究發現，牙周微生物在牙周病的發病中是必需的始動因素，但單純的細菌因素不足以解釋疾病的復雜性和嚴重性，易感的宿主以及某些能增加宿主易感性的因素是影響牙周病發生、發展和對治療反應的重要因素。應激（stress）指機體在遭受各種有害刺激時所處的一種狀態，此狀態的基礎是體內出現一系列神經內分泌反應。許多心理免疫學和流行病學研究證實，免疫系統作為牙周病的調節因素， 可被心理應激反應通過神經內分泌系統影響并調節牙周炎的發生。

本研究擬通過建立大鼠應激牙周炎實驗動物模型，探討限制性應激在實驗性牙周炎發生發展過程中的作用，從而為進一步闡明應激在牙周炎發生過程中的作用提供實驗依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1建立大鼠實驗性牙周炎動物模型

清潔級雄性SD大鼠48只，6周齡，體重160～180 g，購于浙江大學實驗動物中心。無特殊致病菌的環境中適應性飼養1周后實驗。這項研究中所有大鼠的處理根據浙江大學動物倫理委員會實驗協議。

實驗性牙周炎模型的建立：參照Kimura等[7]的方法，選定大鼠左上頜第一磨牙為實驗牙，在其頸部用浸有牙周致病菌的0.012 mm不銹鋼結扎絲進行結扎，并使結扎絲盡量位于齦溝內，結扎絲在整個實驗過程中一直保留作為口腔微生物的滯留裝置。右上頜第一磨牙不做任何處理，作為陰性對照。

1.2 牙齦指數的測量

參照文獻報道[8]對牙齦情況進行分級，分為4級：0表示牙齦健康；1表示牙齦輕度炎癥：牙齦的顏色有輕度改變并輕度水腫，探診不出血；2表示牙齦中等炎癥：牙齦色紅，水腫光亮，探診出血；3表示牙齦嚴重炎癥：牙齦明顯紅腫或有潰瘍，并有自動出血傾向。栓絲后1、2、3、4周后，使用鈍頭牙周探針檢查大鼠牙周情況，探診檢查實驗牙牙齦的頰側中部、頰側遠中和腭側中部、腭側遠中，這4個點的均值代表該牙的分數。

1.3 應激刺激方案

牙周炎實驗動物模型建立成功后，隨機選取24只大鼠進行限制性應激刺激：將大鼠用自制的大鼠制動器固定身體，動物不能隨意移動，不能進食、進水，每天制動12 h。實驗分組如下：空白組（G1）：包括非應激大鼠右上頜第一磨牙；單純性牙周炎組（G2）：包括非應激大鼠左上頜第一磨牙；限制性應激組（G3）：包括應激大鼠右上頜第一磨牙；限制性應激+牙周炎組（G4）：包括應激大鼠左上頜第一磨牙，應激刺激方案執行后第2、3、4、5周，在應激大鼠和非應激大鼠中隨機處死6只。

1.4促腎上腺皮質激素（ACTH）、皮質酮 （CORT）的測定

各組大鼠處死前于非麻醉狀態下取尾部末梢血0.5 mL置于肝素抗凝管，冰凍保存待測；麻醉后心臟穿刺取血2 mL置于肝素抗凝管，37℃恒溫水浴2 h，3000 r/min離心20 min，取上清液（血漿），冰凍保存待測；將血液和血漿標本采用放射免疫分析法分別測定腎上腺皮質激素、皮質酮水平。

1.5檢測牙槽骨喪失量（AL）

各組大鼠處死后取上頜骨，去凈軟組織，用1%亞甲基藍液顯示牙槽嵴頂的位置。測量上頜第一磨牙頰側中部、頰側遠中、腭側中部、腭側遠中的釉牙骨質界至牙槽嵴頂的距離，這4個位點測量值的均值作為該牙的牙槽骨喪失值。

1.6 統計學處理

采用SPSS 10.0統計學軟件進行分析，組內前后比較采用配對t檢驗，組間不同時間點的比較采用方差分析。P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠牙周炎動物模型牙齦指數

在各個時間段，牙周結扎側（G2、G4組）牙齦指數明顯高于未結扎側（G1、G3組）（P < 0.01），證明牙周結扎對于大鼠牙周炎的發生有效。

2.2 ACTH和CORT檢測結果

應激組大鼠（G3、G4組）體內的ACTH和CORT水平明顯高于同時期非應激組大鼠（G1、G2組）（P < 0.01）。在前3周，應激組大鼠ACTH水平呈遞增趨勢，但第5周ACTH水平含量較第4周有所下降。從第2周開始，非應激組大鼠CORT含量逐漸增高，并且第5周非應激組大鼠CORT含量與應激組相比差異最明顯。

2.3 牙槽骨喪失程度（AL）

通過對G1組和G2組大鼠上頜第一磨牙AL的比較可以發現，栓絲后的G2組大鼠的AL均高于未栓絲的G1組大鼠（兩組比較，第2、3、4、5周 t值分別為12.38、12.02、13.07、10.95，P均 < 0.01），從第2周開始，AL逐漸增高，證明牙周炎大鼠的模型建立成功。與G2組比較，在給予限制性應激處理后的G4組大鼠的AL均明顯高于在同一時間檢查的G2組大鼠（G2和G4兩組比較，P均< 0.01），并且第5周兩組間差異最大；通過對G4組大鼠不同時間內檢測的AL數據進行分析可以發現，從第2周開始，隨著應激時間的增加，AL也會有所增加（F = 5.606，P < 0.01）。G1組和G3組之間沒有明顯差異（P均> 0.05）。

3 討論

3.1 模型建立的評價

國外有研究結果證明，大鼠是嚙齒類動物，其牙槽骨、牙齦及牙周組織學特征與人類相似，適合作為牙周炎動物模型。SD大鼠的生物學特性還包含：①是晝伏夜動雜食動物。②喜啃咬，性情較溫順，抗病力強。③大鼠汗腺不發達。④嗅覺靈敏。⑤對噪聲敏感。⑥垂體、腎上腺功能發達，應激反應敏感，行為表現多樣等。基于上述這些特性，SD大鼠非常適合建立牙周炎應激模型[9]。牙頸部結扎是誘發大鼠牙周炎的傳統方法，通過結扎促進局部菌斑、牙石堆積形成，從而引發牙周組織的破壞，已是一種較成熟的方法。本實驗通過對大鼠結扎側和未結扎側牙齦指數及牙槽骨喪失測量結果的對比可以證明，牙頸部結扎可以有效導致大鼠結扎區牙周炎的發生。

3.2 限制性應激牙周炎的影響

任何軀體或心理的刺激，只要到達一定強度，除了引起與刺激因素直接相關的特異性變化外，都可以引起一組與刺激因素的非直接關系的全身非特異反應，這種反應就是應激。關于應激對牙周炎影響的臨床研究已有很多報道，但基于動物實驗的研究不多，尤其是在國內，很少有相關研究。

從目前的研究結果可以得知，應激反應通過神經和神經—內分泌調節免疫系統的途徑至少有3條。第1條途徑是下丘腦—下垂體—腎上腺素（HPA）軸，第2條途徑是交感神經系統，第3條途徑是感覺肽能神經途徑。因此，應激可以通過這3條途徑對牙周病發揮各種不同的作用。在以往的國內外研究中，嘗試構建心理應激的方式有很多，例如冰敷法、減尾法、高溫刺激等不同方式來嘗試使實驗樣本產生并達到預期的心理應激反應。但是，通過制動來引發的限制性應激在強度、頻率、持續的時間等方面便于控制，所以目前被國內外廣大學者所采納。

本實驗所采用的制動器是跟據限制性應激所需要的條件自制的一個制動器。它在不會過分加壓的情況下，可以限制大鼠的自由活動（力量可以調節），同時不會影響到大鼠飲水和呼吸。在將大鼠從制動器放回籠中后方便對其進行沖洗保持里面環境的清潔。完全符合限制性應激制動的要求。本實驗在對大鼠牙周炎模型加入限制性應激后，檢測出大鼠體內應激指標ACTH和CORT含量在應激組均增高，表明實驗動物內分泌系統對應激刺激發生了反應，證明應激牙周炎動物模型建立成功。再通過對各實驗組AL的測量和比較，可以發現在加入限制性應激這一條件后，應激組大鼠結扎側AL明顯高于非應激組大鼠結扎側AL，而應激組大鼠未結扎側AL與非應激組大鼠未結扎側AL無明顯差異，說明限制性應激會加重已發生牙周炎的大鼠牙周組織的牙槽骨吸收，但對未發生牙周炎的大鼠牙周組織沒有影響。通過對應激組大鼠結扎側前4周的AL進行比較可以發現，隨著應激時間的增加，AL也會增加，證明應激時間的長短與大鼠牙周組織的AL呈正相關。

綜上所述，大鼠適合用牙頸部結扎的方法建立限制性牙周炎模型來研究應激與牙周炎的關系。應激對沒有發生牙周炎的牙周組織無任何影響，但對已發生了牙周炎的牙槽骨吸收有促進作用，可以加重牙周炎的發展。隨著應激時間的增加，牙槽骨的吸收程度也會加重。

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（收稿日期：2012—04—11）