STAT3基因與MMP-2、MMP-9在乳腺浸潤性導管癌中的表達及其相互關系

祝立和　盧洪勝　周凱敏　陳國榮

[摘要] 目的 磷酸化信號傳導與轉錄激活因子3蛋白與乳腺浸潤性導管癌中上皮間質轉化（EMT）關系密切，EMT需要降解細胞外基質（ECM），而基質金屬蛋白酶（MMPs）是降解ECM和基底膜（BM）的主要執行者。本研究從EMT角度探討磷酸化信號傳導與轉錄激活因子3（STAT3）基因與MMP-2、MMP-9蛋白在乳腺浸潤性導管癌中的表達及其意義。方法 應用RT-PCR技術檢測30例新鮮乳腺癌及癌旁組織標本的STAT3基因的表達，并以免疫組化方法檢測70例乳腺浸潤性導管癌組織中pSTAT3、MMP-2和MMP-9的表達，分析pSTAT3蛋白與MMP-2、MMP-9表達的關系及其與臨床病理參數的關系。 結果 STAT3mRNA在乳腺癌標本中相對濃度為0.526±0.312，癌旁組織為0.197±0.161，兩組間有顯著統計學差異（P < 0.05）；pSTAT3、MMP-2、MMP-9在乳腺浸潤性導管癌中陽性表達率分別為62.9%、72.8%、67.1%，明顯高于正常乳腺組織19.2%、26.9%、34.6%，具有顯著統計學差異（P 均< 0.05）。MMP-2、MMP-9在不同年齡、腫瘤大小、ER、PR表達組之間比較，差異無統計學意義，而在不同組織學分級、有無淋巴結轉移之間，MMP-2、MMP-9表達有顯著差異（P均<0.05）。 結論 STAT3基因及pSTAT3 與 MMP-2、MMP-9表達在乳腺癌中呈正相關，STAT3基因及pSTAT3和MMP-2 、MMP-9的高表達與乳腺癌的組織學分級與淋巴結轉移相關，STAT3基因可能通過調節MMP-2、MMP-9的表達介導EMT從而促進乳腺浸潤性導管癌的侵襲轉移。

[關鍵詞] 乳腺浸潤性導管癌；信號傳導與轉錄激活因子3；基質金屬蛋白酶-2；基質金屬蛋白酶-9；上皮間質轉化；熒光定量PCR

[中圖分類號] R737.9[文獻標識碼] B[文章編號] 1673-9701（2012）29-0058-04

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，在全球每年新發的120多萬例乳腺癌患者中，約有20萬死于乳腺癌的轉移[1]。而上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的發生被認為是上皮來源的癌細胞發生局部浸潤及遠處轉移的首要事件。EMT是指上皮細胞向間質細胞轉化的復雜過程，在此過程中上皮細胞的極性消失、遷移和運動能力增強同時伴有上皮細胞標志物的丟失而間質細胞標志物的過度表達[2]。目前較為公認的調控EMT的關鍵性轉錄因子主要包括Snail、Smad相互作用蛋白（smad interactionprotein 1，SIP1）和Twist等，新近研究發現信號傳導與轉錄激活因子3（signal transduction and activators of transcription 3，STAT3）信號活化也與腫瘤的EMT有關[3，4]。我們前期的研究也證實在浸潤性乳腺導管癌中pSTAT3與EMT密切相關，活化的STAT3可能通過介導EMT促進乳腺浸潤性導管癌的侵襲轉移[5]。上皮間質轉化需要降解細胞外基質（extracellular matrix，ECM），而基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是降解ECM和基底膜（basement membrane，BM）的主要執行者。我們設計通過檢測STAT3基因及MMPs重要家族成員MMP-2，9蛋白的表達，旨在從EMT角度繼續探討STAT3基因與MMP-2，9蛋白在乳腺浸潤性導管癌中的表達及其意義。

1材料與方法

1.1標本收集

收集溫州市中西醫結合醫院與溫州醫學院附屬第一醫院2011年1～12月行乳腺根治術切除的有完整臨床及病理資料的乳腺浸潤性導管癌病例70例為研究組，26例癌旁正常組織為對照組。另取術中冰凍證實為乳腺浸潤性導管癌的新鮮乳腺癌及癌旁組織30例，液氮凍存，備RT-PCR實驗。

手術后盡快地收集組織標本，避免RNA降解。剔除腫瘤的壞死部分、肌肉及脂肪，確保取材的質量。在盡可能遠離腫瘤的部位（>2 cm）取癌旁組織。先將標本置入凍存管于液氮中速凍，然后移入-80℃低溫冰箱保存備用。

1.3總RNA的提取及逆轉錄為cDNA

標本在盛有液氮的研缽中碾碎后，按RNAeasy試劑盒說明提取總RNA。用紫外分光光度計和甲醛瓊脂糖變性電泳對提取的總RNA進行純度和含量鑒定。OD260/OD280值顯示在1.8～2.0之間。用逆轉錄試劑盒將2 μg總RNA逆轉為cDNA，以上步驟均按試劑盒說明操作。

1.4實時定量PCR檢測

1.5免疫組織化學

所有標本經10％中性甲醛固定，石蠟包埋，以4 m厚度連續切片，常規脫蠟和水化后，免疫組織化學Envision二步法染色按試劑盒說明書操作步驟進行，DAB顯色，蘇木素復染，封片。陰性對照用PBS代替一抗，以已知陽性切片作為陽性對照。

免疫組化染色陽性結果判斷：pSTAT3蛋白陽性表達定位在胞核，血管內皮細胞呈陽性表達，可作為內對照。pSTAT3陽性細胞數≥10％為陽性，<10％為陰性。MMP-2、MMP-9蛋白檢測以細胞漿出現棕黃色顆粒為陽性，對每張切片陽性細胞的陽性強度按無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別打分0，l，2，3分；著色面積按無著色、著色2/3分別評0，l，2，3分。根據兩項得分之和判斷結果：<3分為陰性，≥3分為陽性。每張切片選擇有代表性的區域，在100倍視野下進行計數，共計5個視野，取其平均值以避免隨意性。

1.6統計學處理

2結果

2.1 STAT3mRNA在乳腺浸潤性導管癌中的表達

2.2 pSTAT3、MMP-2和MMP-9蛋白在乳腺浸潤性導管癌中的表達

3討論

上皮間質轉化（EMT）是近年細胞生物學領域的重大發現，由于其與胚胎形成、組織再生以及上皮細胞腫瘤惡性進展等方面均存在重要聯系，因而EMT形成機制的相關研究正成為臨床和基礎研究領域十分活躍的課題，對于眾多疾病的防治具有深遠影響。發生EMT的上皮細胞在經歷了短暫的結構改變后，極性喪失，與周圍細胞和基質的接觸減少，細胞的遷移和運動能力增強。EMT是目前上皮來源的惡性腫瘤發生侵襲轉移的重要原因，已被證實是包括結直腸癌、肺癌等在內的多種惡性腫瘤進展的關鍵環節[6，7]。

細胞外基質由蛋白和多糖組成，分布于全身各組織，為細胞的生長、分化和組織的共存提供合適的環境。大量研究表明，ECM降解主要靠基質金屬蛋白酶家族。它是一組鋅離子依賴性內肽酶，幾乎可以分解細胞外基質的各種成分，促進腫瘤侵襲轉移[8，9]。惡性腫瘤中存在某種因素可使MMPs過度表達，導致基質降解，有利于腫瘤浸潤轉移。目前已發現的MMPs28種，較為重要的是MMP-2和MMP-9，其主要作用底物是包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原、明膠、彈性蛋白。李靖若等[10]報道在乳腺癌中MMP9的表達與淋巴結轉移成正比。Li HC等[11]檢測了270例腋淋巴結陰性乳腺癌中的MMP-2和MMP-9的表達，結果顯示MMP-2表達與腫瘤大小和組織學分級正相關，MMP-9表達與組織學分級正相關。

STAT3是信號傳導與轉錄激活因子家族的重要成員，己被公認為是一種癌基因或類癌基因。當細胞因子或生長因子等激活STAT3上游的Janus激酶（JAK）后，活化的JAK募集胞漿中以單體存在的STAT3分子，使與受體結合的STAT3分子酪氨酸磷酸化后（p-STAT3，Tyr705），STAT3形成同源或異源二聚體從受體上釋放下來，進入細胞核調節靶基因轉錄[12]。STAT3信號活化通過調節E-鈣黏素（E-cadherin）與波形蛋白（Vimentin）的表達介導腫瘤的EMT已有報道證實[3，4，13]，另有研究結果顯示STAT3信號活化能通過誘導細胞外基質降解參與腫瘤的侵襲轉移[14]。

本實驗首先利用熒光定量RT-PCR方法檢測一組30例乳腺癌組織和癌旁組織的STAT3 mRNA表達，結果發現STAT3基因的轉錄產物在乳腺癌標本中相對濃度為0.526±0.312，癌旁組織為（0.197±0.161），兩組間有顯著統計學差異（P < 0.05），表明STAT3 mRNA轉錄表達上調在乳腺癌的發生、發展過程中發揮重要作用。為了較大樣本進一步分析STAT3在乳腺癌中的表達及其與MMPs的關系，我們以70例乳腺浸潤性導管癌為研究組，26例癌旁正常組織為對照組進行pSTAT3、MMP-2和MMP-9的免疫組織化學染色。結果顯示pSTAT3、MMP-2、MMP-9在乳腺癌組織中表達率分別為62.9%、72.8%、67.1%，明顯高于正常乳腺組織，具有顯著統計學差異。MMP-2、MMP-9在不同年齡、腫瘤大小、ER、PR表達組之間比較，差異無統計學意義，而在不同組織學分級、有無淋巴結轉移之間，MMP-2、MMP-9表達有顯著差異（P均< 0.05）。上述實驗結果證實了pSTAT3、MMP-2、MMP-9參與了乳腺癌的浸潤轉移過程，與前述報道基本一致。

另外，對pSTAT3、MMP-2和MMP-9蛋白在乳腺癌組織中的相關性分析中，顯示pSTAT3與MMP-2、MMP-9表達呈正相關，提示pSTAT3可能參與了MMP-2、MMP-9表達調節，通過誘導細胞外基質降解參與腫瘤的侵襲轉移。有研究指出其機制可能是MMP-2、MMP-9作為STAT3下游靶基因，STAT3磷酸化后進行核轉位，調控MMP-2、MMP-9基因的表達[15，16]。

綜上所述，本次研究中發現，STAT3基因在乳腺浸潤性導管癌中呈現高表達，其磷酸化蛋白（pSTAT3）與MMP-2、MMP-9跟乳腺癌的分化、轉移密切相關。活化的STAT3可能通過調節MMPs的表達介導EMT，從而促進乳腺浸潤性導管癌的侵襲轉移。

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（收稿日期：2012-05-24）