兩種刺玫花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)液配方的優(yōu)化

王澤翻,韓倩,楊恒,李亞齊,曾凡景,孫健,趙惠恩

摘要：以報春刺玫（Ｒｏｓａ ｐｒｉｍｕｌａ）和單瓣黃刺玫（Ｒ． ｘａｎｔｈｉｎａ）儲存花粉為材料，設(shè)計單因素試驗和正交試驗，考察了蔗糖、硼酸及Ｃａ（ＮＯ３）２·４Ｈ２Ｏ濃度對兩種刺玫花粉萌發(fā)率的影響。結(jié)果表明，適宜濃度的蔗糖和硼酸能促進(jìn)花粉萌發(fā)，而較高濃度的Ｃａ（ＮＯ３）２·４Ｈ２Ｏ會抑制花粉萌發(fā)。正交試驗結(jié)果表明適合報春刺玫花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基為２０％蔗糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）＋１００ ｍｇ／Ｌ硼酸；適合單瓣黃刺玫花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基為１０％蔗糖＋５０ ｍｇ／Ｌ硼酸。

關(guān)鍵詞：報春刺玫（Ｒｏｓａ ｐｒｉｍｕｌａ）；單瓣黃刺玫（Ｒ． ｘａｎｔｈｉｎａ）；花粉萌發(fā)；液體培養(yǎng)基

中圖分類號：Ｓ６８５．１２；Ｑ９４５．６文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）05－1030-03

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆｏｒｍｕｌａ ｆｏｒ ｉｎ Vｉｔｒｏ Ｐｏｌｌｅｎ Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ

Ｒｏｓａ ｐｒｉｍｕｌａ ａｎｄ Ｒ． ｘａｎｔｈｉｎａ

ＷＡＮＧ Ｚｅ－ｆａｎ，ＨＡＮ Ｑｉａｎ，ＹＡＮＧ Ｈｅｎｇ，ＬＩ Ｙａ－ｑｉ，ＺＥＮＧ Ｆａｎ－ｊｉｎｇ，ＳＵＮ Ｊｉａｎ，ＺＨＡＯ Ｈｕｉ－ｅｎ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ， Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ ｓｔｏｒｅｄ ｐｏｌｌｅｎ ｏｆ Ｒｏｓａ ｐｒｉｍｕｌａ ａｎｄ Ｒ． ｘａｎｔｈｉｎａ ａｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ， ｓｉｍｐｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔｓ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ， Ｈ３ＢＯ３ ａｎｄ Ｃａ（ＮＯ３）２·４Ｈ２Ｏ ｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｏｌｌｅｎ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ ｒｏｓｅ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｓｕｃｒｏｓｅ ａｎｄ Ｈ３ＢＯ３ ａｔ ｐｒｏｐｅｒ ｄｏｓｅ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｏｓｅ ｐｏｌｌｅｎ； Wｈｉｌｅ ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ（ＮＯ３）２·４Ｈ２Ｏ could ｉｎｈｉｂｉｔ ｐｏｌｌｅｎ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒｍｕｌａ ｆｏｒ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒ． ｐｒｉｍｕｌａ ｐｏｌｌｅｎ ｗａｓ ２０％＋ｓｕｃｒｏｓｅ １００ ｍｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３， ａｎｄ ｆｏｒ Ｒ． ｘａｎｔｈｉｎａ ｐｏｌｌｅｎ ｗａｓ １０％ ｓｕｃｒｏｓｅ ＋５０ ｍｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３。

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｒｏｓａ ｐｒｉｍｕｌａ； Ｒ． ｘａｎｔｈｉｎａ； ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｌｅｎ； ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ

報春刺玫（Ｒｏｓａ ｐｒｉｍｕｌａ）、單瓣黃刺玫（Ｒ． ｘａｎｔｈｉｎａ）為薔薇科薔薇屬灌木，是原產(chǎn)我國的早花、耐旱、耐寒、耐病、抗性強種質(zhì)［１］。馬燕等［２］自１９８６年起利用報春刺玫、單瓣黃刺玫與現(xiàn)代月季進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，在眾多雜交后代中選出了多個觀賞性和抗逆性都表現(xiàn)優(yōu)良的品種，可見以兩種刺玫作為父本進(jìn)行雜交育種，培育抗性強的月季品種具有巨大的潛力。但這兩個種花期較早，在北京于４月底至５月初開花，而現(xiàn)代月季品種一般集中在６月開花，父母本花期不相遇，需采集父本花粉進(jìn)行儲藏。

保證儲存的離體花粉有較高的萌發(fā)率是進(jìn)行雜交育種的必要條件，花粉離體萌發(fā)需要合適的條件，其主要因素為溫度和培養(yǎng)基［３］。已有的報道中對月季花粉萌發(fā)培養(yǎng)基的研究多集中在蔗糖和硼酸上，如Ｒｉｃｈｅｒ等［４］研究了３個品種的花粉萌發(fā)最適蔗糖濃度，Ｖｏｙｉａｔｚｉ［５］研究了５個月季品種花粉萌發(fā)所需的蔗糖和硼酸濃度，孫憲芝［６］初步研究了蔗糖和硼酸對一些野生種和現(xiàn)代月季花粉萌發(fā)的影響，但未進(jìn)行系統(tǒng)的培養(yǎng)基組分的優(yōu)化設(shè)計研究。鈣是花粉萌發(fā)的啟動者和花粉管生長的調(diào)節(jié)者［７，８］，適當(dāng)濃度的外源Ｃａ２＋能夠促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管生長［９］。王嵐嵐等［１０］研究了蔗糖、Ｂ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｋ對月季花粉萌發(fā)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蔗糖、Ｃａ（ＮＯ３）２·４Ｈ２Ｏ和硼酸的交互作用對“Ｓｏｒｂｅｔ ｆｒｕｉｔｅ”花粉萌發(fā)有極顯著影響。本研究探討了蔗糖、Ｃａ（ＮＯ３）２·４Ｈ２Ｏ和硼酸對兩種刺玫花粉萌發(fā)的影響，在此基礎(chǔ)上采用正交設(shè)計選出最佳培養(yǎng)液配方，為雜交育種工作提供參考。

１材料與方法

１．１材料

花粉采自北京林業(yè)大學(xué)生長多年的單瓣黃刺玫和報春刺玫的成熟植株上的花朵，花粉散出及收集方法參考孫憲芝［６］的方法，而后置于－２０ ℃儲存。

１．２試驗方法

儲存４０ ｄ后于雜交前取出花粉，先用ＴＴＣ法測定花粉生命力，丟棄無生命力的花粉，取有生命力的花粉進(jìn)行花粉萌發(fā)試驗。采用液體培養(yǎng)基懸滴培養(yǎng)法，將花粉置于２３ ℃條件下培養(yǎng)，２４ ｈ后置于電子顯微鏡下觀察。每種培養(yǎng)液觀察３個玻片，每個玻片觀察３個視野，每個視野不少于１００粒花粉，花粉管長度超過花粉粒半徑的花粉視為萌發(fā)?；ǚ勖劝l(fā)率＝視野內(nèi)萌發(fā)花粉數(shù)／該視野花粉總數(shù)×１００％。

１．２．１單因素試驗分別考察培養(yǎng)液中蔗糖、硼酸和Ｃａ（ＮＯ３）２·４Ｈ２Ｏ濃度對兩種刺玫花粉萌發(fā)率的影響。①蔗糖。培養(yǎng)液中蔗糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為０、５％、１０％、１５％、２０％。②硼酸。培養(yǎng)液中分別添加０、１０、５０、１００、２００ ｍｇ／Ｌ的硼酸。③Ｃａ（ＮＯ３）２·４Ｈ２Ｏ。培養(yǎng)液中Ｃａ（ＮＯ３）２·４Ｈ２Ｏ的濃度分別為０、１０、５０、１００、２００ ｍｇ／Ｌ。

１．２．２正交試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計Ｌ９（３４）正交試驗，考察蔗糖、硼酸和Ｃａ（ＮＯ３）２·４Ｈ２Ｏ濃度３個因素對兩種刺玫花粉萌發(fā)率的影響。因素與水平見表１。

２結(jié)果與分析

２．１單因素試驗結(jié)果

２．１．１蔗糖對兩種刺玫花粉萌發(fā)率的影響以不同濃度蔗糖溶液培養(yǎng)花粉，兩種刺玫花粉萌發(fā)率的變化趨勢相同（表２）。蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為１０％～20％時較適合兩種刺玫花粉的萌發(fā)。蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為１５％時兩種花粉萌發(fā)率最高，報春刺玫為３９．２％，單瓣黃刺玫為２９．９％。蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為２０％時，花粉萌發(fā)率略有下降，表明蔗糖濃度過高會抑制花粉的萌發(fā)。

２．１．２硼酸對兩種刺玫花粉萌發(fā)率的影響報春刺玫花粉萌發(fā)率在硼酸濃度為５０ ｍｇ／Ｌ時最高，為１2．6％；單瓣黃刺玫花粉萌發(fā)率在硼酸濃度為１００ ｍｇ／Ｌ時最高，為8．7％（表３）。硼酸的濃度過高或過低均不利于花粉的生長。

２．１．３Ｃａ（ＮＯ３）２·４Ｈ２Ｏ對兩種刺玫花粉萌發(fā)率的影響Ｃａ（ＮＯ３）２·４Ｈ２Ｏ濃度為１０ ｍｇ／Ｌ時，兩種刺玫花粉萌發(fā)率均最高，報春刺玫為１2．8％，單瓣黃刺玫為１０．０％（表４）。之后隨著Ｃａ（ＮＯ３）２·４Ｈ２Ｏ濃度上升，兩種花粉萌發(fā)率均下降，可見過高的Ｃａ2+濃度會抑制兩種刺玫花粉的萌發(fā)。

２．２正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表５，影響報春刺玫花粉萌發(fā)率的３個因素中，硼酸濃度的影響最大，蔗糖濃度的影響最小。報春刺玫最佳培養(yǎng)液配方為Ａ３Ｂ３Ｃ１，即蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為２０％，硼酸濃度為１００ ｍｇ／Ｌ，不添加Ｃａ（ＮＯ３）２·４Ｈ２Ｏ。影響單瓣黃刺玫花粉萌發(fā)率的因素中，硼酸濃度的影響最大，其次為蔗糖濃度，Ｃａ（ＮＯ３）２·４Ｈ２Ｏ的影響最小。單瓣黃刺玫花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)液配方為Ａ１Ｂ２Ｃ１，即蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為１０％，硼酸濃度為５０ ｍｇ／Ｌ，不加Ｃａ（ＮＯ３）２·４Ｈ２Ｏ。

３結(jié)論與討論

蔗糖在花粉萌發(fā)中主要起到提供能源和調(diào)節(jié)滲透壓的作用［１１，12］。單因素試驗表明，質(zhì)量分?jǐn)?shù)在１０％～２０％的蔗糖溶液較適合兩種刺玫花粉萌發(fā)，其中蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為１５％時兩種刺玫花粉萌發(fā)率最高，該結(jié)果與Ｒｉｃｈｅｒ等［４］的研究結(jié)果一致。孫憲芝［6］研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為５％～８％的蔗糖溶液適于大多數(shù)薔薇屬植物花粉的萌發(fā)，明顯低于本試驗的最適萌發(fā)濃度，可能是由于新鮮花粉與儲存花粉在吸收代謝等方面的差異所致。同時，電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，各單因素試驗中，只添加蔗糖的培養(yǎng)液中萌發(fā)的花粉管長度明顯大于只添加了硼酸或Ｃａ（ＮＯ３）２·４Ｈ２Ｏ的培養(yǎng)液中花粉管的長度，表明適宜濃度的蔗糖對花粉的萌發(fā)起著重要的促進(jìn)作用。

硼能促進(jìn)糖的吸收和代謝，且有利于花粉管壁的形成，可以減少花粉破裂，顯著提高花粉萌發(fā)率，并促使花粉管生長伸長［１３］。單因素試驗顯示，低濃度的硼酸促進(jìn)刺玫花粉的萌發(fā)，硼酸濃度過高，花粉的萌發(fā)率下降，與Ｖｏｙｉａｔｚｉ［５］報道的結(jié)果相符合。

Ｃａ２＋影響花粉管內(nèi)細(xì)胞骨架的生理活動，在花粉管頂端形成較厚的管壁，影響花粉管的生長［１２］。單因素試驗中，Ｃａ（ＮＯ３）２·４Ｈ２Ｏ濃度為１０ ｍｇ／Ｌ時，兩種花粉萌發(fā)率最高，高于此濃度時，兩種花粉萌發(fā)率隨其濃度的升高而下降。

正交試驗中，幾種營養(yǎng)元素同時存在，花粉萌發(fā)率和花粉管的長度顯著高于單因素試驗中只添加一種營養(yǎng)元素時花粉的萌發(fā)率。這可能是由于硼離子能與蔗糖形成絡(luò)合物，使糖易于通過質(zhì)膜在組織中運輸，從而促進(jìn)糖的吸收與代謝，加之硼能參與果膠物質(zhì)的合成，利于花粉管壁的建造［１３］。而Ｃａ２＋的加入在一定程度上抑制了兩種刺玫花粉的萌發(fā)，正交試驗結(jié)果表明不加Ｃａ（ＮＯ３）２·４Ｈ２Ｏ的組合花粉萌發(fā)率反而要高，其原因有待于進(jìn)一步分析。

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