用于Real-time PCR檢測的牛肉組織DＮA提取方法探索

李璟,陳世界,陳洋

摘要：使用Ｃｈｅｌｅｘ－１００提取牛肉組織ＤＮＡ，并用紫外分光光度法檢測所提取的ＤＮＡ濃度和純度，結(jié)果表明所提取的ＤＮＡ Ａ２６０ ｎｍ / Ａ２８０ ｎｍ在１．６６２～１．８２６之間，純度較高。Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ擴增提取的ＤＮＡ模板，表現(xiàn)出較高的敏感性。該ＤＮＡ提取方法效率較高，操作簡便，能夠獲得較高質(zhì)量的ＤＮＡ，適合檢疫部門的快速檢測需要。

關(guān)鍵詞：ＤＮＡ；提?。唬遥澹幔欤簦椋恚?ＰＣＲ；牛肉組織

中圖分類號：Ｑ９５３文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）05－1028-02

Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ of Ｂｅｅｆ Ｔｉｓｓｕｅ's ＤＮＡ ｆｏｒ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

ＬＩ Ｊｉｎｇ１，ＣＨＥＮ Ｓｈｉ-ｊｉｅ２，ＣＨＥＮ Ｙａｎｇ１

（１． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｒｅｅｎ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｍａｔｅｒｉａｌ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００５９，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｓｉｃｈｕａｎ Ｅｘｐｏｒｔ ａｎｄ Ｉｍｐｏｒｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ， Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００４１，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｃｈｅｌｅｘ－１００ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｂｅｅｆ ｔｉｓｓｕｅ． Ｔｈｅ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅｎ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ＵＶ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ Ａ２６０ ｎｍ / Ａ２８０ ｎｍ ｏｆ ＤＮＡ ｗａｓ １．６６２～１．８２６． Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｇｏｏｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ． Ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｏｆ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｉｍｐｌｅ， ｒａｐｉｄ ａｎｄ ａｂｌｅ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ， ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｂｙ ｉｎｓｐｅｃｔ ａｎｄ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＤＮＡ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； rｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ； ｂｅｅｆ ｔｉｓｓｕｅ

肉類食品的安全直接關(guān)系到人類的健康，建立準(zhǔn)確的動物源性成分檢測方法非常重要［１，２］。實時定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）將熒光能量傳遞技術(shù)應(yīng)用于常規(guī)ＰＣＲ中，具有高特異性和高靈敏性［３－５］。提取用于Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ檢測的ＤＮＡ模板的方法很多，酚抽提法、異丙醇沉淀法以及甲酰胺裂解法是提?。模危磷顬榻?jīng)典的方法，但不適用于僅有少量提取材料時［６］。另外，酚、氯仿等有機溶劑易造成環(huán)境污染，有損操作者的健康［７］。玻璃棒纏繞法用鹽酸胍裂解細(xì)胞，這種方法簡單快速，但對操作技術(shù)要求較高，鹽析法用飽和氯化鈉代替有機溶劑去除蛋白質(zhì)，所獲得的ＤＮＡ可以滿足ＰＣＲ的要求，但產(chǎn)率相對較低［８］。用Ｃｈｅｌｅｘ－１００作為金屬離子螯合劑提?。模危?，其原理是細(xì)胞在含有Ｃｈｅｌｅｘ－１００懸濁液中煮沸時，細(xì)胞膜破裂釋放出ＤＮＡ，同時與二價金屬離子螯合，可以避免ＤＮＡ在金屬離子的催化作用下降解，從而獲得純度較高的ＤＮＡ［９，１０］。本實驗采用該法提取牛肉組織ＤＮＡ，并將其應(yīng)用于Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ檢測，探索將該方法運用于動物檢驗檢疫的可行性。

１材料與方法

１．１材料與儀器

４份新鮮牛肉均購自成都市農(nóng)貿(mào)市場；溶液Ⅰ（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)２０％的Ｃｈｅｌｅｘ－１００）；ＭＧＢ－Ｔａｑｍａｎ探針、細(xì)胞色素ｂ基因通用引物（引物１：５′－ＴＡＣＣＡＴＧＡＧＧＡＣＡＡＡＴＡＴＣＡＴＴＣＴＧ－３′，引物２：５′－ＣＣＴＣＣＴＡＧＴＴＴＧＴＴＡＧＧＧＡＴＴＧＡＴＣＧ－３′）訂購自上海基康生物技術(shù)有限公司；實驗儀器包括高速離心機、熒光定量ＰＣＲ儀、漩渦振蕩器、核酸蛋白檢測儀、均質(zhì)儀等。

１．２實驗方法

１．２．１牛肉組織ＤＮＡ的提取方法與步驟稱取新鮮牛肉５０ ｍｇ，加入５００ μＬ生理鹽水，漩渦振蕩１０ ｍｉｎ充分混勻，直至沉淀泛白。１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ，棄上清（若離心沉淀為紅色，繼續(xù)混勻后離心）。在沉淀中加入溶液Ⅰ ３００ μＬ，漩渦振蕩１０ ｍｉｎ，重新懸浮沉淀。沸水浴處理１０ ｍｉｎ，１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ，取上清液待用，共提?。捶菖Ｈ饨M織樣品的ＤＮＡ。

１．２．２ＤＮＡ的濃度及純度測定用核酸蛋白檢測儀在２６０ ｎｍ和２８０ ｎｍ波長下分別測定提取的ＤＮＡ樣品吸光度，并計算Ａ２６０ ｎｍ / Ａ２８０ ｎｍ及ＤＮＡ濃度。

１．２．３Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ檢測提取的ＤＮＡ本實驗的ＰＣＲ程序以ＡＢＩ ＰＲＩＳM ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ為基礎(chǔ)建立。Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ反應(yīng)體系如下：２×Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １２．５ μＬ，引物１和引物２各１．５ μＬ，探針１．５ μＬ，分別加入提取的ＤＮＡ模板０、１、２、３ μＬ，加蒸餾水至２５ μＬ。反應(yīng)程序為：９５ ℃預(yù)變性１０ ｍｉｎ；９５ ℃變性４５ ｓ，５３ ℃退火６０ ｓ，７２ ℃延伸６０ ｓ，４０個循環(huán)［１１］。反應(yīng)過程中通過與循環(huán)變溫加熱器相連的ＣＣＤ攝像檢測熒光值，ＡＢＩ ＰＲＩＳM ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ軟件分析ＤＮＡ擴增曲線。

２結(jié)果與分析

２．１提取的ＤＮＡ濃度和純度檢測結(jié)果

分光光度法檢測結(jié)果表明，提取的４份牛肉組織ＤＮＡ的Ａ２６０ ｎｍ / Ａ２８０ ｎｍ均在１．６６２～１．８２６之間，質(zhì)量較好（表１）。

２．２Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ擴增結(jié)果及檢測

Ｃｔ值即閾值循環(huán)數(shù)，表示能被儀器明顯檢測到的熒光值（ΔＲｎ）到達(dá)設(shè)定的閾值時所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)，在擴增曲線上通常表現(xiàn)為進(jìn)入快速擴增期時的循環(huán)數(shù)。每個模板的Ｃｔ值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ｃｔ值越小。以提取的ＤＮＡ為模板進(jìn)行Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ，結(jié)果顯示加入提取的牛肉組織ＤＮＡ樣品體積分別為３、２、１ μＬ時，得到的ＰＣＲ擴增曲線Ｃｔ值遞增。如圖１中箭頭所示，Ｃｔ值與ＤＮＡ模板量的相關(guān)性較好，ＤＮＡ模板量越大，Ｃｔ值越低。說明用此方法提?。模危粒谟行コ校茫乙种苿┑耐瑫r，沒有降低Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ的敏感性，也避免了ＰＣＲ反應(yīng)假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

３結(jié)論與討論

本實驗采用的Ｃｈｅｌｅｘ－１００是一種離子螯合劑，由苯乙烯和苯二乙烯組成，其懸濁液在堿性環(huán)境（ｐＨ １０～１１）和１００ ℃的條件下可導(dǎo)致細(xì)胞膜的破裂和ＤＮＡ的變性并釋放出來［１２］。使用Ｃｈｅｌｅｘ－１００提?。模危?xí)r，不用蛋白酶Ｋ消化，血紅素從血紅蛋白中的釋放減少，可使獲得的ＤＮＡ純度提高。Ｃｈｅｌｅｘ－１００還可以結(jié)合金屬離子，阻止金屬離子對ＤＮＡ降解的催化作用。同時由于Ｃｈｅｌｅｘ－１００顆?？呻x心去除，不會干擾ＰＣＲ擴增反應(yīng)體系中的Ｍｇ２＋等離子濃度。此外，借助于ＰＣＲ反應(yīng)體系中的緩沖液，其堿性也不會影響到ＰＣＲ的擴增反應(yīng)。Ｃｈｅｌｅｘ－１００提取方法對組織的需求量很少，本實驗中５０ ｍｇ牛肉組織中提取的ＤＮＡ可用于ＰＣＲ擴增的次數(shù)大于３００次（１ μＬ模板量）。本方法提取的ＤＮＡ適用于Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ擴增，省時快速，可用于動物組織的快速檢測。

綜上所述，Ｃｈｅｌｅｘ－１００快速提取牛肉組織ＤＮＡ的方法提取效率較高，實驗操作簡單，無需貴重儀器和有毒化學(xué)物質(zhì)，能夠獲得較高質(zhì)量的ＤＮＡ，且適用于Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ檢測，可被應(yīng)用于動物新鮮組織的ＤＮＡ提取。

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