草甘膦殘留的酶聯免疫分析方法的建立

潘熙萍,樓佳俊,張高精,張麗莎,施曼玲

摘要：通過碳化二亞胺法將草甘膦（Ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ，ＧＬＹ）分別與卵清蛋白（ＯＶＡ）和牛血清白蛋白（ＢＳＡ）偶聯制備免疫原和包被原。基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）檢測表明，草甘膦與牛血清白蛋白和卵清蛋白的偶聯比分別為１１∶１和９∶１。合成的免疫原作用新西蘭大白兔制備出草甘膦多克隆抗體，ＥＬＩＳＡ檢測抗體溶液效價為１∶１×１０７，該抗體不與草甘膦的結構類似物增甘膦和雙甘膦起交叉反應。以此抗體建立了草甘膦間接競爭ＥＬＩＳＡ檢測方法（ｃｉＥＬＩＳＡ），其線性范圍為０．７８～１００ μｇ/ｍＬ，線性回歸方程為ｙ＝１５．８５１ ０ ｌｎｘ＋７．７８０ ５，Ｒ２＝０．９９３ ８。草甘膦的檢測限為ＩＣ１０＝１．１５ μｇ／ｍＬ，ＩＣ５０＝１４．３５ μｇ／ｍＬ。在添加回收試驗中，草甘膦添加值５和１０ μｇ／ｇ時，玉米粉中的草甘膦回收率為１０４．１２％和８１．３７％，小麥粉中的回收率則分別為１１８．９４％和為１０９．３９％。結果表明，采用所制備的多克隆抗體而建立的草甘膦ｃｉＥＬＩＳＡ方法可有效地應用于玉米粉和小麥粉中草甘膦的殘留檢測。

關鍵詞：草甘膦（Ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ，ＧＬＹ）；多克隆抗體；間接競爭酶聯免疫吸附法

中圖分類號：Ｓ４８２．４文獻標識碼： Ａ文章編號：0439－８114（２０12）05－1002-04

Establishment ｏf ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Assay for Ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ

ＰＡＮ Ｘｉ－ｐｉｎｇ，ＬＯＵ Ｊｉａ－ｊｕｎ，ＺＨＡＮＧ Ｇａｏ－ｊｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｌｉ－ｓｈａ，ＳＨＩ Ｍａｎ－ｌｉｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００３６， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｄｉｉｍｉｎｅ ｃａｒｂｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ ａｎｄ ｃｏａｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｙ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｂｅｉｎｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｔｏ ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ） ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ ｈａｐｔｅｎ ｔｏ ＢＳＡ ａｎｄ ＯＶＡ ｗｅｒｅ １１∶１ ａｎｄ ９∶１ ｂｙ ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ-ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）． Ｔｈｅ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｗｅｒｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｒａｂｂｉｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ． Ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｗａｓ １∶１×１０７ ｂｙ ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ （ＥＬＩＳＡ）． Ｔｈｅ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｉｄ ｎｏｔ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｇｌｙｐｈｏｓｉｎｅ ａｎｄ Ｎ－（Ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｍｅｔｈｙｌ） ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ． Ａｎ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ （ｃｉＥＬＩＳＡ） ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ， ｗｈｉｃｈ ｈａｓ ａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ （ＩＣ１０） ｏｆ １．１５ μｇ／ｍＬ ａｎｄ ａ ｌｉｎｅａｒ ｗｏｒｋｉｎｇ ｒａｎｇｅ ｏｆ ０．７８～１００ μｇ ／ｍＬ ｗｉｔｈ ａｎ ＩＣ５０ ｖａｌｕｅ ｏｆ １４．３５ μｇ/ｍＬ． Ｔｈｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｗａｓ ｙ＝１５．８５１ ０ ｌｎｘ＋７．７８０ ５，Ｒ２ ｗａｓ ０．９９３ ８． Ｗｈｅｎ ５ ａｎｄ １０ μｇ／ｇ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｗａｓ ａｄｄｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｅｘｅｐｅｒｉｍｅｎｔｓ， ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｏｆ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｗｅｒｅ １０４．１２％ ａｎｄ ８１．３７％ ｉｎ ｃｏｒｎ ｍｅａｌ ｓａｍｐｌｅｓ， ｗｈｉｌｅ １１８．９４％ ａｎｄ １０９．３９％ ｉｎ ｗｈｅａｔ ｆｌｏｕｒ ｂｌａｎｋ ｓａｍｐｌｅｓ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｉＥＬＩＳＡ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｗａｓ ａｂｌｅ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｃｏｒｎ ｍｅａｌ ａｎｄ ｗｈｅａｔ ｆｌｏｕｒ ｓａｍｐｌｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ； ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ； ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ

草甘膦（Ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ，ＧＬＹ）化學名為Ｎ－（膦酸甲基）甘氨酸，是一種非選擇性廣譜除草劑，是當前世界上應用最廣、生產量最大的除草劑，也是目前我國使用量最大的除草劑［１］。先前的研究表明草甘膦對哺乳動物急性毒性低，且在生物體內不易積累，故對人類和其他哺乳動物不會產生明顯危害［２］。但是，近年越來越多的研究表明草甘膦對哺乳動物發育、繁殖和內分泌系統都會產生一定的負面影響［３－６］。

草甘膦進入環境會對生態環境產生有害影響，并通過在食物中的殘留對人類健康構成威脅。目前，《食品中農藥最大殘留限量》明確規定了草甘膦在稻谷、小麥、小麥粉、全麥粉、玉米、水果、甘蔗和棉子油中的最大殘留限量。２００６年頒布的國家《生活飲用水衛生標準》也增加了對草甘膦的檢測要求。

目前有關食品中草甘膦殘留分析方法主要采用液相色譜和氣相色譜法，另外還有液－質聯用、氣－質聯用和離子色譜法等［７］。但由于草甘膦極性強，易溶于水，難溶于大多數有機溶劑，沒有發色和熒光基團等特性，使得液相色譜法需要各種衍生技術的使用。此外，草甘膦與自然界存在的氨基酸和氨基糖的相似性，也使采用色譜法測定谷物與動物產品中的草甘膦殘留更加困難，必須借助于繁瑣的離子交換柱凈化程序，但實驗操作復雜，難度大，無法滿足草甘膦快速檢測的需要。因此，研制草甘膦殘留的快速檢測方法，加強食品和環境中草甘膦殘留的檢測與監控，對保障人類健康具有重要意義。本研究制備了草甘膦的多克隆抗體，并建立了快速靈敏的草甘膦間接競爭ＥＬＩＳＡ（ｃｉＥＬＩＳＡ）檢測方法，為進一步研制免疫檢測試劑盒奠定基礎。

１材料與方法

１．１材料和儀器

草甘膦標準品純度＞９９％，購自德國Ｅｈｒｅｎｓｔｏｒｆｅｒ公司；牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、卵清蛋白（ＯＶＡ）、辣根過氧化物酶（ＨＲＰ）標記羊抗兔抗體（酶標二抗）、弗氏完全佐劑（ＦＣＡ）、弗氏不完全佐劑（ＦＩＡ）均購自Ｓｉｇｍａ公司；其他化學試劑為國產分析純。新西蘭雄性大白兔購自杭州師范大學動物中心。主要儀器設備包括ＢＩＯ－ＲＡＤ ６８０型酶標儀，Ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ型基質輔助激光解析飛行時間質譜儀（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ，美國Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ公司）。

１．２草甘膦包被原和免疫原的制備與鑒定

草甘膦包被原ＧＬＹ－ＢＳＡ和免疫原ＧＬＹ－ＯＶＡ的制備方法參照文獻［８］。通過ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ質譜儀測定ＧＬＹ與ＢＳＡ以及ＧＬＹ與ＯＶＡ偶聯前后分子質量的變化，以判斷偶聯是否成功，并計算偶聯比。

１．３草甘膦多克隆抗體的制備及純化

２ ｍL免疫原ＧＬＹ－ＯＶＡ與等體積弗氏完全佐劑乳化后，采用背部皮下和腋窩多點注射的方法免疫新西蘭大白兔。２周后，２ ｍｇ ＧＬＹ－ＯＶＡ與等體積的弗氏不完全佐劑乳化后注射免疫，免疫方法同上。之后每間隔１周加強免疫１次，兔子耳靜脈采血測定抗體效價。最后一次免疫劑量加倍，免疫后７ ｄ頸部采血，血樣在室溫下靜置凝結３０ ｍｉｎ后，４ ℃下過夜，次日離心取上清分裝后于－２０ ℃保存。采用飽和硫酸銨鹽析法純化抗血清溶液，純化后抗體溶液分裝置于－８０ ℃保存。

１．４草甘膦多克隆抗體的鑒定及效價測定

用間接ＥＬＩＳＡ法進行草甘膦多克隆抗體鑒定及抗體效價測定，具體步驟如下：①包被。分別以ＯＶＡ、ＢＳＡ、ＧＬＹ－ＢＳＡ為包被原，倍比稀釋后加入酶標板中，１００ μＬ／孔，４ ℃過夜；洗滌３次，每次間隔３ ｍｉｎ，拍干。②封閉。加入５ ％ 脫脂奶粉封閉，２００ μＬ／孔，３７ ℃孵育１ ｈ，拍干。③加一抗。加入倍比稀釋的草甘膦抗體１００ μＬ，３７ ℃溫育１ ｈ，洗滌同上。④加酶標二抗。加入１∶１０ ０００ 稀釋的羊抗兔酶標二抗，１００ μＬ／孔，３７ ℃孵育１ ｈ，洗滌同上。⑤顯色。加入ＴＭＢ底物顯色液，１００ μＬ／孔，３７ ℃顯色１５ ｍｉｎ。⑥終止讀數。加入２ ｍｏｌ／Ｌ的硫酸終止顯色反應，５０ μＬ／孔，用酶標儀測定其ＯＤ４５０nm值。設置陰性對照，以ＯＤ值Ｐ／Ｎ＞２．１為陽性判斷標準。

１．５間接競爭ＥＬＩＳＡ（ｃｉＥＬＩＳＡ）檢測方法的建立

分別將包被原ＧＬＹ－ＢＳＡ和草甘膦多克隆抗體溶液倍比稀釋，進行間接ＥＬＩＳＡ方陣實驗，選取ＯＤ４５０nm值在１．０左右的包被原和抗體濃度為最適工作濃度。建立ｃｉＥＬＩＳＡ檢測方法，實驗步驟如下：以最適工作濃度的ＢＳＡ－ＧＬＹ為包被原包被酶標板，４ ℃過夜，洗滌，封閉；１００ μＬ草甘膦標準品溶液與等體積最適工作濃度的草甘膦抗體混合，設置空白對照和不抑制對照，３７ ℃孵育４０ ｍｉｎ，然后轉移到封閉好的酶標板中，１００ μＬ／孔，３７ ℃孵育４０ ｍｉｎ，洗滌。后續實驗步驟如加酶標二抗、顯色和終止讀數同１．４中方法。

１．６標準曲線的繪制

分別配制０．７８、１．５６、３．１２、６．２５、１２．５０、２５．００、５０．００和１００．００ μｇ／ｍＬ的草甘膦標準品溶液，采用ｃｉＥＬＩＳＡ法測定不同濃度的草甘膦標準品對抗體與包被原結合的抑制率，抑制率按文獻［９］中的公式進行計算。以草甘膦各標準品溶液的對數濃度為橫坐標，以抑制率為縱坐標，繪制標準曲線。以ＩＣ５０來衡量抗體對草甘膦的親和力，以ＩＣ１０為該ＥＬＩＳＡ方法的檢測靈敏度指標。

１．７草甘膦多克隆抗體的特異性測定

采用ｃｉＥＬＩＳＡ法，分別測定草甘膦多克隆抗體與草甘膦結構類似物雙甘膦、增甘膦的交叉反應率，根據交叉反應率高低鑒定抗體的特異性。交叉反應率的計算公式如下：

交叉反應率＝（ＧＬＹ的ＩＣ５０／ＧＬＹ類似物的ＩＣ５０）×１００％。

１．８添加回收試驗

取１ ｇ空白樣品（小麥粉和玉米粉）溶于水，添加草甘膦標準品，使樣品的濃度為５和１０ μｇ／ｇ。添加回收試驗方法參照文獻［９］，并計算添加回收率。

２結果與分析

２．１草甘膦包被原與免疫原的制備與鑒定結果

通過碳化二亞胺法將ＧＬＹ分別與ＢＳＡ和ＯＶＡ偶聯，偶聯物通過ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ質譜儀測定分子質量，結果見圖１和圖２。質譜檢測表明２個偶聯物ＧＬＹ－ＢＳＡ和ＧＬＹ－ＯＶＡ的分子質量分別為６９ ０４０．１ u和５３ ６２６．９ u，與ＢＳＡ的６７ ２２９．２ u和ＯＶＡ的５２ １７０．２ u的分子質量差異明顯，說明偶聯成功。計算得出１分子ＢＳＡ與１１分子的ＧＬＹ偶聯，１分子ＯＶＡ與９分子的ＧＬＹ偶聯，即ＧＬＹ與ＢＳＡ、ＧＬＹ與ＯＶＡ的偶聯比分別為１１∶１和９∶１。

２．２草甘膦多克隆抗體的純化、鑒定及效價測定結果

采用飽和硫酸銨法對獲得的草甘膦抗血清進行純化，紫外分光光度計測定純化后的多抗溶液濃度為３．６８ ｍｇ／ｍＬ。間接ＥＬＩＳＡ檢測表明所制備的草甘膦多抗與ＧＬＹ－ＢＳＡ呈陽性反應。該試驗結果證實了通過免疫、純化等實驗過程已成功獲得草甘膦多克隆抗體。間接ＥＬＩＳＡ方法測得草甘膦多抗溶液效價為１∶１×１０７。

２．３ｃｉＥＬＩＳＡ檢測方法的建立

包被原原始濃度為１．２１ ｍｇ／ｍＬ，將包被原和草甘膦多抗分別倍比稀釋，利用間接ＥＬＩＳＡ進行方陣試驗，考慮到實際應用時要求有較高的檢測靈敏度，并盡可能減少非特異性反應，確定ｃｉＥＬＩＳＡ分析方法中包被原與草甘膦多抗的最適工作濃度為：包被原稀釋倍數為２．０×１０４，草甘膦多抗稀釋倍數為４．０×１０３。

２．４標準曲線的繪制

采用ｃｉＥＬＩＳＡ法檢測，并根據公式計算不同濃度的草甘膦對抗體的抑制率。以草甘膦標準品溶液的對數濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制草甘膦標準曲線（圖３），表明草甘膦在０．７８～１００ μｇ／ｍＬ范圍內，抑制率與濃度呈線性關系，線性回歸方程為ｙ＝１５．８５１ 0 ｌｎｘ＋７．７８０ ５，Ｒ２＝０．９９３ ８，ＩＣ５０＝１４．３５ μｇ/ｍＬ，ＩＣ１０＝１．１５ μｇ／ｍＬ，即抑制率為１０％時草甘膦的檢測限為１．１５ μｇ／ｍＬ。

２．５ 草甘膦多克隆抗體的特異性測定結果

通過ｃｉＥＬＩＳＡ法檢測、計算出草甘膦多抗與草甘膦及類似物的交叉反應率，結果見表１。草甘膦多抗與雙甘膦和增甘膦的交叉反應率均小于０．０１％，而與草甘膦的交叉反應率為１００％，說明所制備的草甘膦多抗具有較高的特異性。

２．６添加回收試驗結果

選擇ＧB２７６３－２００５所規定的草甘膦殘留檢測的兩種農產品小麥粉和玉米粉的空白樣品，進行草甘膦添加回收試驗，結果見表２。草甘膦添加值為５ μｇ／ｇ和１０ μｇ／ｇ時，玉米粉中的回收率分別為１０４．１２％和８１．３７％；小麥粉中的回收率則分別為１１８．９４％和１０９．３９％。試驗結果表明，采用所制備的多克隆抗體建立的草甘膦ｃｉＥＬＩＳＡ方法，可有效地應用于玉米粉和小麥粉中草甘膦的殘留檢測。

３小結與討論

以抗原抗體的特異性反應為核心的酶聯免疫吸附技術是近年來發展最快的微量檢測技術，廣泛應用于農產品中農藥、抗生素等殘留的檢測［１０］。酶聯免疫吸附技術具有靈敏度高、特異性強、對儀器設備和人員素質要求低以及樣品前處理簡單等優點，適于現場監測和大規模樣品篩選［１１］，ＥＬＩＳＡ技術也為草甘膦殘留分析提供了新方法，Ｃｌｅｇｇ等［８］制備了兔抗草甘膦多克隆抗體，建立了草甘膦ｃｉＥＬＩＳＡ檢測方法，檢測限達７．６ μｇ／ｍＬ。本研究利用抗血清制備技術獲得了高特異性的草甘膦多克隆抗體，間接ＥＬＩＳＡ檢測結果表明草甘膦多抗效價為１∶１×１０７。采用所制備的多克隆抗體建立的草甘膦ｃｉＥＬＩＳＡ方法，其檢測草甘膦的線性范圍為０．７８～１００ μｇ/ｍＬ，檢測限ＩＣ１０為１．１５ μｇ/ｍＬ，比Ｃｌｅｇｇ等報道的低，因而檢測更靈敏，可有效地應用于小麥粉和玉米粉中的草甘膦殘留檢測。草甘膦ｃｉＥＬＩＳＡ檢測方法的建立，為進一步開發免疫檢測試劑盒奠定了基礎，并為食品和環境中草甘膦殘留的監控提供便捷、快速和靈敏的檢測方法。

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