鵝巴氏桿菌油佐劑滅活疫苗的研制

王學理,鄢長慶,劉珂飛,楊明,楊明霞

摘要：為了有效控制霍爾多巴吉鵝巴氏桿菌病（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌｏｓｉｓ）的發生，將內蒙古通遼地區分離鑒定的巴氏桿菌作為菌種，采用液體增菌培養后滅活，加入佐劑制成油乳劑滅活疫苗，經無菌和安全檢驗合格后免疫２０日齡雛鵝（０．５ ｍＬ／只）。結果表明，該疫苗免疫效果良好，１次免疫后保護率達７３．３％，２次免疫后保護率達９６．７％。

關鍵詞：巴氏桿菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）；霍爾多巴吉鵝；疫苗

中圖分類號：Ｓ８５８．２９９；Ｓ８５２．４文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）05－0965-03

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｏｉｌ－ａｄｊｕｓｔ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｇｏｏｓｅ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ mｕｌｔｏｃｉｄａ

ＷＡＮＧ Ｘｕｅ－ｌｉ１，２，ＹＡＮ Ｃｈａｎｇ－ｑｉｎｇ２，ＬＩＵ Ｋｅ－ｆｅｉ２，ＹＡＮＧ Ｍｉｎｇ２，ＹＡＮＧ Ｍｉｎｇ－ｘｉａ１

（１． Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ， Ｔｏｎｇｌｉａｏ ０２８０４２， Inner Mongolia，Ｃｈｉｎａ；

２．Ｔｉａｎｊｉｎ Ｓｈｅｎｇｊｉ Ｇｒｏｕｐ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ， Ｔｉａｎｊｉｎ ３００３８４， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌｏｓｉｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｏｌｚｅｒ ｂｕｇｇｙ ｇｏｏｓｅ， ｔｈｅ ｏｉｌ－ａｄｊｕｓｔ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｏｆ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｔｏｎｇｌｉａｏ ｗａｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｔｏ ２０－ｄａｙ－ｏｌｄ Ｈｏｌｚｅｒ ｂｕｇｇｙ ｇｏｏｓｅ at ａ ｄｏｓｅ ｏｆ ０．５ ｍＬ ａｆｔｅｒ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｗａｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ， ｗｉｔｈ a ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ７３．３％ ａｆｔｅｒ ｉｎｉｔｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ９６．７％ ａｆｔｅｒ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ； Ｈｏｌｚｅｒ ｂｕｇｇｙ ｇｏｏｓｅ； vａｃｃｉｎｅ

鵝巴氏桿菌病（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌｏｓｉｓ）是由禽多殺性巴氏桿菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）引起的一種鵝的急性、敗血性、高度接觸性傳染病。常引起鵝的急性敗血癥及組織器官出血性炎癥，其特征是高熱、下痢、呼吸困難［１］。巴氏桿菌血清型較多，采用藥物防控效果比較好，但停藥一段時間又復發，造成經常用藥，易產生抗藥性，增加飼養成本，故疫苗的免疫接種是預防該病的一種較好的辦法。本研究旨在探討霍爾多巴吉鵝內蒙古通遼地區巴氏桿菌分離株油乳劑滅活疫苗的制備和對鵝的免疫保護效果，為該病的預防提供一種方法。

１材料與方法

１．１病料

２０１１年８月中旬，內蒙古通遼某養殖場送檢的霍爾多巴吉商品鵝病、死鵝。

１．２菌株分離鑒定

１．２．１分離培養將肝、肺、脾等病料無菌接種于鮮血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板，３７ ℃培養１８～２４ ｈ，挑取單個菌落，進行純培養并鑒定。

１．２．２菌株鑒定挑取上述純培養菌落抹片，瑞氏、美藍和革蘭氏染色，鏡檢。

１．２．３細菌生化試驗將純化好的疑似巴氏桿菌菌株分別接種于尿素、精氨酸、明膠、葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖、甘露醇、鼠李糖、乳糖、肌醇、菊糖、ＭＲ、Ｖ－Ｐ、Ｈ２Ｓ、石蕊牛乳等生化培養基，３７ ℃培養２４～４８ ｈ，觀察結果，同時與標準菌株進行比較。

１．３動物試驗

用滅菌生理鹽水與病死鵝肝、脾組織研磨，制成１０％懸液，接種于１０只小白鼠皮下，每只０．２ ｍＬ，觀察小鼠死亡時間，取鼠肝、脾等臟器涂片染色，鏡檢。

１．４巴氏桿菌懸液的制備與滅活

選定菌株接種于血液瓊脂培養基上，３７ ℃培養１８ ｈ，挑取培養物接種于馬丁肉湯（含０．１％血紅素，１．０％血清）培養基中，３７ ℃振蕩培養１８ ｈ，純度檢查后作為種子液。然后將合格的種子液按照１０％的比例再接種于制苗用的馬丁肉湯中，３７ ℃振蕩培養２４ ｈ，收集菌液。在培養過程中每４ ｈ振搖１次，菌液培養經純度檢查合格后計數，保證含菌量達到２．５×１０１０ ＣＦＵ／ｍＬ。再向菌液中均勻加入０．３％的甲醛，３７ ℃滅活４８ ｈ。菌液滅活后再取樣接種于血液瓊脂培養基上，觀察是否有細菌生長。

１．５巴氏桿菌油佐劑滅活疫苗的制備

將滅活菌液加入２％吐溫－８０為水相，油相為９２％白油、６％司班－８０和２％硬脂酸鋁，混合均勻。然后將油相與水相按體積比３∶１的比例混合，經高速組織勻漿機充分乳化后備用。

１．６巴氏桿菌油佐劑滅活疫苗的質量檢驗

１．６．１無菌檢驗取油佐劑滅活疫苗接種于血液瓊脂培養基，觀察細菌生長情況。

１．６．２黏度檢驗采用流出法觀察油佐劑滅活疫苗從取液器吸管自然流出的時間。

１．６．３穩定性檢驗采用離心加速分層法，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，觀察液體分層情況。

１．６．４安全檢驗選擇８只２周齡健康的霍爾多巴吉雛鵝，頸部皮下注射制備好的疫苗１．０ ｍＬ／只，連續１５ ｄ觀察試驗鵝注射部位、采食及精神狀況。

１．７巴氏桿菌油佐劑滅活疫苗免疫效果觀察

將２０日齡健康霍爾多巴吉雛鵝９０只隨機分成３組舍飼，第１組：２０日齡皮下接種疫苗，劑量為０．５ ｍＬ／只，分別在２７、３０、３５日齡時各取１０只攻毒，觀察發病情況。第２組：２０日齡時第一次皮下接種疫苗，劑量為０．５ ｍＬ／只，３０日齡時按相同方法和劑量第二次免疫，然后分別在３７、４０、４５日齡時各取１０只攻毒。第３組：為對照組，分別于２０、３０日齡時每只皮下注射無菌生理鹽水０．５ ｍＬ，然后在３７、４０、４５日齡時分別取１０只攻毒。攻毒方法均為頸部皮下注射鵝巴氏桿菌菌液０．４ ｍＬ／只。

２結果

２．１臨診及剖檢結果

鵝群突然發病，３ ｄ內死亡率達３５％。送檢病鵝肉髯腫大發紺，糞便呈黃綠色或水樣混有血液的稀便，從口、鼻中流出黏液，呼吸困難。有的發生關節腫脹，表現跛行或行走不便，后期發生癱瘓。剖檢咽喉部有大量分泌物，肝臟腫大、質脆，表面有針尖大小的出血點和灰白色壞死灶，十二指腸黏膜發生嚴重的出血性炎癥，膽囊腫大，心內、外膜有出血斑，肺臟出血，呼吸道黏膜呈環狀充血，皮下組織及腹部脂肪有針尖大出血點。

２．２菌株分離鑒定結果

分離菌株在麥康凱培養基上不生長；鮮血瓊脂培養基上長出圓形隆起、濕潤、邊緣整齊、灰白色、中等大小的菌落，并有熒光性。用堿性美藍或瑞氏染色液染色，顯微鏡檢查可見大小為（０．２～０．４）μｍ×（０．５～２．５）μｍ的卵圓形、典型兩極著色的小球桿菌，單個或成雙排列，無芽孢；革蘭氏染色鏡檢為陰性。

用血平板上分離出的菌株進行生化試驗。結果顯示，該菌不能分解尿素和精氨酸，不液化明膠；同時，該菌可以分解果糖、半乳糖、蔗糖、葡萄糖和甘露醇，產酸不產氣；對鼠李糖、肌醇、菊糖、乳糖不能分解，ＭＲ、Ｖ－Ｐ、石蕊牛乳試驗均為陰性，Ｈ２Ｓ試驗陽性。

２．３動物試驗結果

１０只小白鼠均于接種后１８ ｈ內死亡。剖檢可見接種部位皮下組織出現水腫，心包和胸腔有漿液性、纖維素性滲出物，心內外膜出血，肝臟、淋巴結腫大。取心血接種于鮮血瓊脂培養基上作培養，置３７ ℃培養２４ ｈ有細菌生長，菌落形態及涂片染色特點同“2.2”。

２．４巴氏桿菌油佐劑滅活疫苗的質量檢驗

無菌檢驗表明，該疫苗在血液瓊脂培養基上無菌落生長，滅活效果良好；在室溫下隨機取１ ｍＬ疫苗從取液器吸管自然流出時間約４ ｓ，符合油佐劑疫苗的黏度要求（４～６ ｓ）；將制備的疫苗滴于蒸餾水表面，油滴呈規則圓形，保持１５ ｍｉｎ以上不擴散；３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，疫苗無分層現象，穩定性良好。

將疫苗接種于８只２周齡健康霍爾多巴吉雛鵝，連續１５ ｄ觀察，未見不良反應，所有試驗鵝全部存活；剖檢試驗鵝，注射部位未見腫脹、化膿等異常表現，表明疫苗具有較高的安全性。

２．５巴氏桿菌油佐劑滅活疫苗的免疫保護效果

由表１可見，１次免疫后平均保護率為７３．３％，２次免疫后平均保護率為９６．７％，疫苗免疫效果良好。

３討論

巴氏桿菌廣泛存在于自然界和畜禽體內。因此該病有自體感染和外源性感染。正常存在于多種健康動物的口腔和咽部黏膜，當動物抵抗力下降時，細菌侵入體內，大量繁殖并致病，發生內源性傳染。致病因素常為氣候變化、營養、損傷、興奮、飼養管理和潛伏性疾病等。因此，平時應加強飼養管理，嚴格衛生消毒制度，鵝糞應及時清理，病、死鵝應焚燒或深埋處理。每天供給新鮮清潔的飼料，并根據不同的生長發育階段，補充適當的精料，掌握“單一飼養，全進全出”兩個生產管理原則［２］。

從免疫效果來看，本試驗制備鵝巴氏桿菌油佐劑滅活疫苗在一免后７ ｄ有６０％的保護率，１０ ｄ和１５ ｄ后均有８０％的保護率。而二免７ ｄ后就能產生較好的免疫力。霍爾多巴吉商品鵝一般６０ ｄ左右出欄，因而對該品種商品鵝選擇兩次免疫可有效抵抗巴氏桿菌對機體的感染。

近年來，鵝巴氏桿菌病時有發生［３－５］，并且耐藥性逐漸增強。目前，許多中小型水禽養殖戶疫苗免疫意識淡薄、隨意使用抗生素，結果導致該病發病率和死亡率逐漸攀升，病原耐藥譜越來越廣。因此，養殖戶除了要具備良好的飼養管理條件，疫苗的免疫和抗生素的合理使用也尤為重要。霍爾多巴吉鵝是匈牙利的一個優良品種，因具有增重快、肉質鮮嫩、蛋白質含量高、低脂肪、低膽固醇、營養價值高以及產毛多等優點而備受青睞，我國很多地區已大范圍推廣養殖。巴氏桿菌血清型眾多，各地區存在一定的差異，在對該品種進行疫苗免疫時，要根據當地鵝疫情的發展變化制定適合本場的免疫程序，最好采用與致病菌抗原性相一致的巴氏桿菌油佐劑滅活疫苗進行免疫，才能取得事半功倍的效果。

參考文獻：

［１］ 許英民．自家組織苗在防控種鵝巴氏桿菌病上的應用［Ｊ］．獸醫導刊，２００７（１２）：３６－３７．

［２］ 陳桂先，鄧玉英． 一起鵝巴氏桿菌病的診治與體會［Ｊ］．養禽與禽病防治，２００８，２７（４）：４２－４３．

［３］ 王彩麗，匡紅艷，榮俊，等．多殺性巴氏桿菌ＰＣＲ檢測方法的建立［Ｊ］．黑龍江畜牧獸醫（科技版），２０１１（８）：１２９－１３０．

［４］ 張佰娣，陸偉． 吉林地區鵝巴氏桿菌病病原分離鑒定及藥敏試驗［Ｊ］．畜牧獸醫科技信息，２００８（１２）：２８－２９．

［５］ 孫紅軍，王春香．鵝巴氏桿菌病的診斷及防治措施［Ｊ］．養殖技術顧問，２００９（１０）：９９．