生物酶法提取沙棘果渣總黃酮工藝的優化

徐升運,趙文娟,陳衛鋒,任平,秦濤

摘要：用生物酶法提取沙棘（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ）果渣中的總黃酮，通過單因素試驗和正交試驗優化提取工藝。結果表明，酶解體系各因素對總黃酮提取率影響的大小順序為酶用量、酶解溫度、酶解時間、ｐＨ，最佳提取條件為生物酶用量占沙棘果渣質量的４％、ｐＨ ５、酶解溫度６０ ℃、酶解時間１２０ ｍｉｎ，料水質量比１∶３０，此條件下總黃酮提取率可達到０．７９６％。與有機溶劑回流法和超聲波法相比，生物酶法所得沙棘果渣的總黃酮提取率分別提高了５１．９１％和４８．５１％。

關鍵詞：生物酶法；沙棘（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ）果渣；總黃酮；提取工藝

中圖分類號：Ｒ２８４．２；Ｓ７９３．６文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）05－0983-03

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏ－ｅｎｚｙｍｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｏｔａｌ Ｆｌａｖｏｎｅｓ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｍａｒｃ ｏｆ Ｓｅａ Ｂｕｃｋｔｈｏｒｎ

ＸＵ Ｓｈｅｎｇ－ｙｕｎ１，ＺＨＡＯ Ｗｅｎ－ｊｕａｎ１，ＣＨＥＮ Ｗｅｉ－ｆｅｎｇ２，ＲＥＮ Ｐｉｎｇ１，ＱＩＮ Ｔａｏ２

（１． Ｅｎｚｙｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｓｈａａｎｘｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｘｉａｎ ７１０６００， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｓｈａａｎｘｉ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｘｉａｎ ７１０６００， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｂｉｏ－ｅｎｚｙｍｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｍａｒｃ ｏｆ ｓｅａ ｂｕｃｋｔｈｏｒｎ（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ）； ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉon ｃｒａｆｔ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉon ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ， ｅｎｚｙｍｅ ｄｏｓｅ， ４％ ｏｆｔｈｅ ｍａｓｓ ｏｆ marc of ｓｅａ ｂｕｃｋｔｈｏｒｎ； ｐＨ， ５； Tｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ６０ ℃； Tｉｍｅ， １２０ ｍｉｎ； Mａｓｓ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｗａｔｅｒ， １∶３０． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ ｗａｓ ｕｐ ｔｏ ０．７９６％． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｈｅａｔ ｒｅｆｌｕｘ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｌｔｒａ－ｓｏｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｂｉｏ－ｅｎｚｙｍｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ５１．９１％ ａｎｄ ４８．５１％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｂｉｏ－ｅｎｚｙｍｅ ｍｅｔｈｏｄ； ｍａｒｃ ｏｆ sｅａ ｂｕｃｋｔｈｏｒｎ（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ）； ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｅｓ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

沙棘（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ Ｌ．）又名醋柳，是胡頹子科沙棘屬的多年生灌木，是極為珍貴的藥食兩用植物，其果實、枝桿、葉中含有多種生物活性物質和營養成分［１］。沙棘總黃酮是研究最多的沙棘活性成分之一，具有抗心肌缺血、降血脂、抗腫瘤，調節免疫系統等藥理作用［２－４］。經過大量人工種植與對野生沙棘資源的合理保護與開發，中國已成為沙棘種植第一大國，沙棘資源的開發與利用為中國“三北”貧困地區農民增收脫貧發揮了巨大作用。目前我國中西部沙棘加工企業主要是用帶短枝沙棘果實榨汁和取油，榨汁后產生的大量果渣常被丟棄，僅有少部分被用作廉價的飼料。而有研究表明，沙棘總黃酮在其果渣中的含量還相當高［５］，有的甚至高于其在果汁與油中的含量［６］。因此，研究沙棘果渣總黃酮的提取對延伸沙棘加工產業鏈，提升沙棘開發利用的經濟價值具有積極意義。

已有的報道主要探討了有機溶劑結合超聲、微波、熱加工等物理方法提取沙棘果渣中總黃酮的方法［５－８］，而生物酶法可利用酶的專一性高效降解并充分釋放出原料中的總黃酮，可以提高提取率、減少有機溶劑用量、簡化提取流程。本研究主要應用單因素試驗和正交試驗優化生物酶提取沙棘果渣中總黃酮的方法，并與化學提取法相比較，以期得到更優的提取工藝和品質更高的沙棘黃酮產品，為沙棘高端醫藥產品的生產提供原料，為沙棘資源的開發與利用提供理論依據。

１材料與方法

１．１材料與儀器

沙棘果渣，于２００９年８月取自吳起縣某野生沙棘加工企業，主要含果皮、果渣和沙棘短枝，６０ ℃干燥制粉，過１００目篩備用。

試劑：復合酶（由纖維素酶與果膠酶組成，使用最佳ｐＨ為４．０～６．０）；蘆丁（Ｂ．Ｒ），聚酰胺粉（粒度為２００～３００目，柱層析用），乙醇、甲醇、氫氧化鈉均為分析純。儀器：貝克曼Ｄ６４０紫外分光光度儀；ＳＫ２５０超聲發生器；電子天平（精度０．１ ｍｇ，北京賽多利斯儀器系統有限公司）。

１．２方法

１．２．１沙棘總黃酮含量的測定［９］分別吸取濃度為50 μｇ／ｍＬ的蘆丁標準溶液０、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０ ｍＬ于１０ ｍＬ比色管中，加甲醇至刻度，搖勻，測定３６０ ｎｍ處吸光度，以蘆丁濃度為橫坐標，Ａ３６０ ｎｍ為縱坐標繪制標準曲線，得蘆丁濃度Ｃ（μｇ／ｍＬ）對吸光度Ｙ（Ａ３６０ ｎｍ）的回歸方程Ｙ＝０．０２５ ５Ｃ－０．００４ ４，Ｒ２＝０．９９９ ４。

１．２．２沙棘果渣總黃酮提取工藝流程①生物酶法。沙棘果渣→烘干→粉碎→生物酶酶解→醇溶液浸提→取上清液→濃縮→黃酮粗品→分析。②超聲波法［４］。沙棘果渣→加入溶劑（乙酸乙酯、乙醇等）→超聲波提取→過濾→濃縮→蒸干溶劑→黃酮粗品→分析。③有機溶劑回流法［４］。沙棘果渣→加入溶劑（石油醚、乙醇等）→熱回流提取→過濾→濃縮→蒸干溶劑→黃酮粗品→分析。

１．２．３單因素試驗分別考察酶解體系生物酶用量、ｐＨ、酶解溫度、酶解時間、料水質量比對沙棘果渣總黃酮提取率的影響。①生物酶用量。在料水質量比１∶４０，酶解溫度５０ ℃，ｐＨ ５．０，酶解時間６０ ｍｉｎ，生物酶用量分別占沙棘果渣質量的１％、２％、３％、４％、５％和６％的條件下提取總黃酮，考察生物酶用量對總黃酮提取率的影響。②ｐＨ。在生物酶用量占沙棘果渣質量的４％，酶解溫度５０ ℃，料水質量比１∶４０，酶解時間６０ ｍｉｎ，ｐＨ分別為３、４、５、６、７的條件下提取總黃酮，考察ｐＨ對總黃酮提取率的影響。③酶解溫度。在料水質量比１∶４０，生物酶用量占沙棘果渣質量的４％，ｐＨ為５．０，反應時間６０ ｍｉｎ，酶解溫度分別為３０、４０、５０、６０、７０ ℃的條件下提取總黃酮，考察酶解溫度對總黃酮提取率的影響；④酶解時間。在料水質量比１∶４０，生物酶用量占沙棘果渣質量的４％，ｐＨ ５．０，酶解溫度５０ ℃，酶解時間分別為３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０ ｍｉｎ的條件下提取總黃酮，考察酶解時間對總黃酮提取率的影響。⑤料水質量比。在生物酶用量占沙棘果渣質量的４％、ｐＨ ５．０、酶解溫度５０ ℃、酶解時間１２０ ｍｉｎ，酶解體系中料水質量比分別為１∶１０、１∶２０、１∶３０、１∶４０、１∶５０、１∶６０的條件下提取總黃酮，考察料水質量比對總黃酮提取率的影響。測定所得提取液的Ａ３６０ ｎｍ，計算其中總黃酮的濃度和質量，總黃酮提取率＝提取所得總黃酮的質量／沙棘果渣質量×１００％。

１．２．４正交試驗設計在單因素試驗的基礎上，設計Ｌ９（３４）正交試驗，優化提取工藝，因素和水平見表１。

２結果與討論

２．１生物酶用量對沙棘果渣總黃酮提取率的影響

隨著反應體系中酶用量的增加，沙棘果渣總黃酮提取率呈上升趨勢（圖１），但當酶用量達到沙棘果渣質量的４％后，再增加酶的用量，總黃酮提取率增加幅度不明顯，從節約成本、提高提取率的角度考慮，本試驗選擇生物酶添加量為沙棘果渣質量的４％。

２．２ｐＨ對沙棘果渣總黃酮提取率的影響

酸性或堿性過強，酶的催化作用都會受到抑制。本研究中酶解體系的ｐＨ為５時酶的活性最強，總黃酮提取率最高；ｐＨ小于５時，總黃酮提取率隨ｐＨ的升高呈增加趨勢；ｐＨ大于５時，總黃酮提取率隨ｐＨ的升高減?。▓D２）。

２．３酶解溫度對沙棘果渣總黃酮提取率的影響

沙棘果渣總黃酮提取率先隨著溫度的升高而增大，在５０ ℃時達到最大值，當溫度高于５０ ℃時，黃酮提取率略有下降（圖３）。原因可能是生物酶酶解最適溫度為５０ ℃，溫度過低或過高，酶的活力都降低，從而導致酶解效率受到影響。

２．４酶解時間對沙棘果渣總黃酮提取率的影響

沙棘果渣總黃酮提取率隨著酶解時間的延長而增大，但當酶解時間超過１２０ ｍｉｎ時，總黃酮提取率隨酶解時間的延長增加不顯著（圖４），故選擇酶解時間為１２０ ｍｉｎ。

２．５料水質量比對沙棘果渣總黃酮提取率的影響

沙棘果渣總黃酮提取率先隨酶解體系中加水量的增加不斷增加，當料水質量比為１∶３０時提取率最大，之后再加大水的用量，總黃酮提取率下降（圖５），且加水量過大、料水質量比過小會造成成本增加，并給后期濃縮純化帶來不便，所以選擇料水質量比為１∶３０。

２．６正交試驗結果

正交試驗結果見表２，由表２可知，４個因素對沙棘果渣總黃酮提取率影響的大小順序為酶用量、酶解溫度、酶解時間、ｐＨ。生物酶法提取沙棘果渣總黃酮最佳工藝為Ａ３Ｂ２Ｃ３Ｄ２，即酶用量為沙棘果渣質量的４％，ｐＨ ５．０，酶解溫度６０ ℃，酶解時間１２０ ｍｉｎ。

２．７３種沙棘果渣總黃酮提取方法的比較結果

稱取相同質量的沙棘果渣樣品，分別采用正交試驗優化后的生物酶法、超聲波法和有機溶劑回流法提取沙棘果渣總黃酮，結果見表３。由表３可知，總黃酮提取率從大到小依次為生物酶法、超聲波法、有機溶劑回流法，其中生物酶法提取的總黃酮提取率比有機溶劑回流法和超聲波法的提取率分別提高了５１．９１％和４８．５１％，差異顯著，且生物酶法和超聲波法與有機溶劑回流法相比用時短、操作次數少。因此，生物酶法提取總黃酮提取率高、操作簡便，是一種比較理想的提取方法，具有較好的發展前景。

３結論

３．１生物酶法提取沙棘果渣總黃酮工藝的優化結果

生物酶解處理與醇提相結合進行沙棘果渣總黃酮的提取是一種有效的方法，通過單因素試驗和正交試驗考察酶解體系中各因素對提取率的影響。優化的酶解體系為酶用量占沙棘果渣質量的４％，ｐＨ ５．０，酶解溫度６０ ℃，酶解時間１２０ ｍｉｎ，料水質量比１∶３０。

３．２生物酶法與傳統提取方法的比較

對有機溶劑回流法、超聲波法與生物酶法進行比較，發現生物酶法比超聲波法、常規熱回流法提取率明顯提高，同時縮短了提取時間，簡化了操作步驟，且生物酶法不會造成有機物的殘留與污染，因此生物酶法在沙棘果渣總黃酮提取上具有明顯優勢，這將為沙棘果渣的開發利用提供一種更佳的方法與思路，有較好的發展前景。

參考文獻：

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