Notch1胞內(nèi)段在鼻咽癌組織及鼻咽癌細胞株中的表達研究

張芳婷，萬匯涓，李明華，劉曉翌，尹美珺，葉 靜，于 潔

Notch信號通路作為經(jīng)典的調(diào)節(jié)細胞增殖和分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在一系列生理和病理過程中起著重要作用。近年來研究證實，Notch信號通路參與了鼻咽癌的發(fā)生過程，但至今機制仍不明確。探討其在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用將為發(fā)現(xiàn)鼻咽癌治療的新靶點提供理論基礎(chǔ)。由于非角化性鼻咽癌 (nonkeratin naspharyngeal carcinoma，NK-NPC)是鼻咽癌高發(fā)區(qū)的主要類型，因此本研究擬通過免疫組化染色與分子生物學技術(shù)研究Notch1在鼻咽癌中的表達。

1 材料與方法

1．1 材料 CNE1、CNE2鼻咽癌細胞株購自深圳欣海凌生物科技有限公司，SUNE-1、SUNE-1亞株5-8F、SUNE-1亞株6-10B及SUNE-1亞株9-4E鼻咽癌細胞株購自湘雅醫(yī)學院細胞中心，52個NK-NPC標本以及10例鼻黏膜炎癥標本來源于北京大學深圳醫(yī)院耳鼻喉科，由北京大學深圳醫(yī)院病理科提供。

1．2 試劑 1640培養(yǎng)基 (GIBCO公司)、胎牛血清 (FBS，GIBCO公司)、磷酸鹽緩沖液 (PBS，GIBCO公司)、胰蛋白酶 (AMRESCO公司)、青鏈霉素(雙抗100×，Hyclone)、臺盼藍 (SIGMA公司)。RNA提取試劑盒 (QIAGEN)，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Fermentas)，單克隆抗人Notch1 IC抗體 (RD)，即用型免疫組化Elivision TM super試劑盒 (邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司);RNA提取試劑盒 (Qiagen公司);RT-PCR試劑(Fermentas公司);DNA Maker I(Tiangen公司);人Notch1引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，上游引物5′-GCCGCCTTTGTGCTTCTGTTCTTC-3′，下游引物 5′-CCCGTGCGGTCTGTCTGGTTGTG-3′，產(chǎn)物長度為506 bp。內(nèi)參 β-actin擴增片段大小204 bp，序列為F:GTGACGTGGACATCCGCAAAG，R:GGAGAATGGACAGCGAGGC。

1．3 方法

1．3．1 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)法檢測 將各種鼻咽癌細胞株常規(guī)培養(yǎng)至3代，收集細胞，TRIZOL抽提RNA;RT-PCR操作按說明書進行，擴增條件為:48℃ 45 min;94℃ 2min;94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，35個循環(huán);72℃ 7 min，采用1．2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行分析。

1．3．2 免疫細胞化學染色 常規(guī)制備細胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，晾干后備用。實驗時先用過氧化物酶阻斷劑、非免疫血清各反應(yīng)10 min，甩棄多余液體后加抗人Notch1 IC抗體室溫孵育60 min。PBS洗后，加生物素標記二抗10 min、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶10 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，逐級乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下選取數(shù)個高倍視野進行細胞計數(shù)，共計1 000個細胞。

1．3．3 免疫組化染色 常規(guī)石蠟切片，切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水至水化，雙蒸水洗5 min，3%H2O2甲醇液滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，微波熱修復(fù)95℃20min，自然冷卻。蒸餾水洗5 min，PBS洗10 min，滴加山羊血清封閉，室溫10 min;滴加一抗，室溫1 h或4℃過夜，PBS洗3次，5 min/次;滴加生物素標記二抗，室溫10 min，PBS洗3次，5 min/次;滴加過氧化物標記的鏈霉親和素，室溫10 min，PBS洗3次，5 min/次;滴加DAB顯色劑，鏡下控制，蒸餾水終止顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、中性樹膠封片。

1．3．4 結(jié)果判定標準 免疫組化染色可定位于細胞核、細胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒。每張切片均于400倍光鏡下隨機觀察10個高倍視野1 000個細胞，陽性細胞數(shù)＜20%為陰性，≥20%為陽性。

1．3．5 病理學檢測 常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察肝臟組織細胞和形態(tài)學變化。

1．4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料采用Personχ2檢驗和確切概率法。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 RT-PCR檢測 經(jīng)RT-PCR后，瓊脂糖凝膠電泳顯示了不同鼻咽癌細胞株中Notch1基因的表達情況，可見各組細胞在506 bp的位置均出現(xiàn)產(chǎn)物帶，其中以CNE1表達最強，其他細胞株表達較弱 (見圖1)。

2．2 免疫細胞化學染色 制備細胞爬片，免疫細胞化學染色結(jié)果顯示:人Notch1胞內(nèi)段 (NIC)在CNE1細胞株中有陽性表達，在其他細胞株中幾無表達 (見圖2)。

2．3 免疫組化染色 在未分化型鼻咽癌中，癌巢內(nèi)無陽性表達，周圍淋巴細胞陽性表達;在分化型鼻咽癌中，癌細胞陽性表達明顯，而在鼻咽慢性黏膜炎癥組織幾乎未見陽性表達。NIC陽性染色為棕色，陽性表達位置不固定，可見于胞膜、胞核，或彌漫表達于胞質(zhì)中。在未分化型鼻咽癌中定位于核內(nèi)陽性細胞較分化型鼻咽癌多 (見圖2)。在未分化型鼻咽癌中可見數(shù)量不等的淋巴細胞浸潤。病理學染色及免疫組化染色結(jié)果對比顯示:癌巢本身Notch1染色呈陰性表達，而癌巢內(nèi)浸潤的淋巴細胞則表達陽性。

2．4 鼻咽癌組織中NIC的表達高于鼻咽慢性黏膜炎癥組織(χ2=7．8，P=0．005)。對所有鼻咽癌臨床標本進行性別、年齡、組織學分型方面的統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)NIC的表達在不同年齡、性別患者中差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0．05);而在未分化型和分化型鼻咽癌中，NIC的陽性表達率差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0．05，見表 1)。

3 討論

Notch信號通路由受體、配體和CSL DNA結(jié)合蛋白3部分組成。其經(jīng)典作用路徑為:當Notch受體受到配體的刺激后，身為跨膜受體蛋白的Notch分子由細胞膜上的蛋白酶復(fù)合物催化發(fā)生蛋白裂解，使NIC從細胞膜內(nèi)側(cè)釋放并進入核內(nèi)。進入核內(nèi)的胞內(nèi)段與轉(zhuǎn)錄因子RBP-J相互作用，激活含有RBP-J識別位點的啟動子的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)細胞分化相關(guān)基因如Hes家族分子的表達，并調(diào)節(jié)細胞的分化［1］。

圖1 鼻咽癌細胞株中人Notch1基因的表達Figure 1 Electrophoretogram of Notch1 mRNA RT-PCR product

圖2 人Notch1胞內(nèi)段在鼻咽癌細胞及組織中的表達Figure 2 Expression of Notch1 intracellular domain in NK-NP C

表1 NIC在鼻咽癌中的表達情況Table 1 Expression of NIC in the NPC

Notch信號通路參與了鼻咽癌的發(fā)生過程，但至今機制仍不明確。病因?qū)W研究顯示:鼻咽癌的發(fā)生與EBV感染密切相關(guān)。EBV感染的B淋巴細胞永生化依賴于EB病毒核心抗原2(EBNA2)。EBNA2通過與Notch通路的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子RBP-J結(jié)合以活化c-myc、CD21、CD23、STAT6等基因，從而達到調(diào)控EBV對B淋巴細胞感染的過程［2］。因此，目前有推測認為:這一感染途徑可能的機制是，上皮細胞與EBV陽性B淋巴細胞緊密接觸進而引發(fā)上皮細胞感染［3］。

在哺乳動物的4種Notch受體 (Notch1～4)中，Notch1與腫瘤的關(guān)系最為密切［4-5］，因此，本研究選擇具有活性的NIC以研究其在鼻咽癌中的表達。

本研究結(jié)果顯示，在不同分化程度鼻咽癌細胞、組織中NIC表達有所差異，與患者年齡、性別無相關(guān)性，而與細胞分化程度相關(guān)，呈現(xiàn)分化程度越低表達量越低的趨勢。從慢性炎癥組織到分化型鼻咽癌，再到未分化型鼻咽癌，NIC的表達量逐漸增加，其定位由胞質(zhì)至胞核，而未分化型鼻咽癌NIC主要表達于侵入癌巢的淋巴細胞上，提示Notch1在鼻咽癌發(fā)生中有促進作用，其作用途徑可能與淋巴細胞侵潤相關(guān)。這一結(jié)果符合有關(guān)EBV感染鼻黏膜上皮細胞機制的推斷，也與Wang等［6］的研究結(jié)果基本一致，而Notch1受體活化途徑和EB病毒感染途徑是否一致，還有待進行深入探討和研究。

1 Artavanis-Tsakonas S，Rand MD，Lake RJ．Notch signaling:cell fate control and signal integration in development［J］．Science，1999，284(5415):770-776．

2 Barozzi P，Potenza L，Riva G，etal．B cells and herpesviruses amodel of lymphoproliferation［J］．Autoimmun Rev，2007，7(2):132-136．

3 Zong YS，Zhong BL，Liang YJ，et al．Advancement of studying the biological characteristics of nasopharyngeal carcinogenesis［J］．Ai Zheng，2002，21(6):686-695．

4 Radtke F，Raj K．The role of Notch in tumorgenesis:oncogene or tumor suppressor?［J］．Nature Rev，2003，3(10):756-767．

5 Nicolas M，Wolfer A，Raj K，et al．Notch1 functions as a tumor suppressor in mouse skin ［J］．Nature Genet，2003，33(3):416-421．

6 Wang M，Li JT，Zeng YX，et al．Expression and Significance of Notch1，P21WAF1 and involucrin in nasopharyngeal carcinoma［J］．Ai Zheng，2005，24(10):1230-1234．