表面等離子共振生物傳感器檢測磺胺類藥物殘留*

符運良，張鐵民，王林茂

(海南師范大學 物理與電子工程學院，海南 ?？?71158)

0 引 言

食品安全問題關系到人們的生命健康安全，得到了人們越來越多的重視。其中，食品中獸藥殘留問題是一個較突出的問題，食用過量的獸藥殘留的動物源性食品對人類的健康造成危害。世界上許多國家和組織對動物性食品中獸藥殘留都規定了最大的殘留量，如美國和歐盟規定動物的可食用組織中的磺胺獸藥殘留總量不得超過100 μg/kg［1］。目前，對于動物性食品中獸藥殘留的檢測有很多種方法，如傳統的微生物檢測法［2］、高效液相色譜(HPLC)法［3］、酶聯免疫法(ELISA)［4］，這些方法要么耗時間過長，或檢測精度低，儀器設備昂貴，同時，這些方法通常是一種檢測方法對應一種藥物殘留，不容易實現多種殘留的分析檢測?；诒砻娴入x子共振(surface plasmon resonance，SPR)效應的生物傳感器免疫法是近年來發展的一種新的檢測方法，其具有實時監測分子間的相互作用、無需標記、定量準確等特點，已被廣泛應用于藥物研究［5］、食品分析［6］、環境監測［7］等領域。20 世紀 90 年代，瑞典的 Biacore公司將SPR 生物傳感器技術引入獸藥殘留分析中，目前，已生產出多種檢測試劑盒。國內已有利用SPR 技術進行獸藥殘留的研究［8～9］，該技術方法具有樣品前處理相對簡單、高特異性、分析快捷、定量準確等優勢［10］。本研究利用SPR 技術，建立磺胺二甲嘧啶的檢測方法，該方法簡單、快速、靈敏度高，重復性好，適用于大量的無標記的雞蛋或牛奶中獸藥殘留的檢測。

1 實 驗

1.1 磺胺二甲嘧啶芯片的制備

將裸金膜傳感器芯片放入儀器中，在空氣環境條件下進行格式化，然后，選擇第2 個通道，注入蒸餾水，流過芯片表面，點擊標定，出現SPR 曲線，待曲線穩定后，向金膜表面流動注入1 mol/L 11-巰基十一烷酸，時間約3 h，而后，用PBS 緩沖液沖洗，信號穩定后，在金膜表面固定一層羥基。將 0.4 mol/L EDC 和0.1 mol/L NHS(1∶1，體積比)混合后注入，活化金膜表面的羥基，形成活性酯，時間約1 h，用PBS緩沖液沖洗，注入溶液的流速均為10 μL/min，磺胺二甲嘧啶-牛血清白蛋白用醋酸緩沖液(pH =4.4)1∶50 稀釋，以10 μL/min流速注入儀器中，信號穩定后，用PBS 緩沖液沖洗，這樣抗原便固定在金膜上;最后，將1 mol/L 乙醇胺(pH=8.5)以10 μL/min 的流速注入，封閉金膜上未被蛋白結合的活性位點，PBS 緩沖液沖洗，完成分子識別膜的制備，原理結構如圖1 所示。

圖1 SPR 傳感器結構圖Fig 1 Structure diagram of SPR sensor

1.2 抗體工作濃度的選擇

磺胺二甲嘧啶單克隆抗體，用PBS 緩沖液分別稀釋為1∶100，1∶200，1∶500，1∶1000，1∶5000 倍，與濃度分別為 1，40 mg/L磺胺二甲嘧啶的PBS 緩沖液混合后，注入芯片表面，反應10 min，比較曲線，根據檢測限的要求與檢測范圍，選擇抗體工作適當的濃度。

由于抗體濃度高時，抑制樣品的濃度也隨著增加，導致檢測的靈敏度下降，檢測限提高;抗體濃度過低，競爭的抑制樣品濃度范圍變小，但抗體濃度越低時，檢測限就越低，越有利于檢測，選擇較低濃度的工作抗體濃度1∶5000 稀釋。

1.3 建立抑制標準曲線

以工作抗體濃度與含有不同濃度(0，1.2，2.4，8，11.5 mg/L)磺胺二甲嘧啶的PBS 緩沖液，在室溫(20 ℃)下混合4 min，注入傳感器中，以信號強度為縱坐標，以時間為橫坐標，繪制競爭抑制曲線。

1.4 構建牛奶樣品濃度抑制標準曲線

將無抗牛奶(市場購買)稀釋10 倍后，離心機10000 r/min離心5 min，取中間層，加入磺胺二甲嘧啶，濃度分別為 0，0.4，0.8，5，10，50，100 mg/L，加入工作抗體，注入儀器中，以信號強度為縱坐標，以濃度的對數值為橫坐標，繪制牛奶中的磺胺二甲嘧啶濃度添加競爭抑制標準曲線。

2 實驗結果與分析

2.1 芯片表面固定磺胺二甲嘧啶抗原過程

將 0.4 mol/L EDC 和0.1 mol/L NHS(1∶1，體積比)混合后注入，活化金膜表面的羥基，形成活性酯，時間約7 min，SPR信號上升。用PBS 緩沖液沖洗，注入溶液的流速均為10 μL/min，將磺胺二甲嘧啶-牛血清白蛋白用醋酸液(pH=4.4)1:50 倍，以 10 μL /min 注入儀器中，結合信號上升，信號穩定后，用PBS 緩沖液沖洗，這樣抗原便固定在金膜上;最后將 1 mol/L 乙醇胺(pH =8.5)以 10 μL/min 的流速注入，滅活封閉金膜上未被蛋白結合的活性位點，PBS 緩沖液沖洗，完成分子識別膜的制備，整個過程的SPR 傳感信號如圖2 所示。

圖2 芯片表面固定抗原過程Fig 2 Process of immobilization of antigen on chip surface

2.2 磺胺二甲嘧啶濃度抑制標準曲線的建立

圖3 為利用SPR 傳感器免疫法檢測PBS 中的磺胺二甲嘧啶所得的標準曲線，從上到下，濃度依次為0，1.2，2.4，8.0，11.5 mg/L。特異性抗原與抗體結合，在結合階段信號強度表現為上升的結合曲線，特異性結合較為穩定，抗體與固定于芯片表面的抗原結合后，通入PBS 緩沖液達到一個相對穩定的狀態，當通入洗脫液0.1 mol/L HCl 或0.1 mol/L NaOH 溶液，在洗脫液的作用下，才能迅速解離，基線恢復回到反應前的高度。

2.3 牛奶樣品中磺胺二甲濃度抑制標準曲線的建立

圖4 為牛奶樣品中，磺胺二甲嘧啶濃度分別為0，0.4，0.8，5，10，50，100 mg/L，加入抗體(工作濃度)，注入儀器中，以信號強度為縱坐標，濃度以10 為底對數為橫坐標，繪制得的牛奶的藥物殘留濃度標準曲線。將一定濃度的抗體與樣品混合后，如果樣品中的含有磺胺二甲嘧啶，部分抗體將被與磺胺二甲嘧啶結合，不能再與芯片表面的抗原結合，這樣導致結合到芯片表面的抗體減少，結合值SPR 信號下降。因此，通過以不同質量濃度的磺胺二甲嘧啶與一定濃度的抗體混合，就可獲得競爭抑制的標準濃度曲線。此外，測量樣品時，由測得的數據與標準樣品曲線進行比較，可計算出牛奶樣品中磺胺二甲嘧啶的殘留濃度值。由上述實驗測得的數據，Sigmoidal 即S 型非線性關系擬合得擬合方程

y=A2+(A1－A2)/(1 +(x/x0)p).

其中，A1=3 657.724 56，A2=3010.444，x0=9.503 5，P=1.506 43。質量濃度測定線性范圍為3 ～48 mg/L，可以實現牛奶樣品的磺胺二甲嘧啶濃度范圍的檢測，最低檢測濃度低于國家允許的標準限100 mg/L。

圖3 抗體與抗原特異性結合的響應曲線與再生過程Fig 3 Response curves and regeneration process of specific binding between antibody and antigen

圖4 牛奶中磺胺二甲嘧啶競爭抑制標準曲線Fig 4 Standard competitive inhibition curve of sulfamethazine in milk

2.4 樣品濃度回收率的測定

對5 個添加磺胺二甲嘧啶的樣品(40 mg/L)，分析其回收率，測定結果如表1 所示，回收率定義為各次樣品檢測值與檢測平均值之比值，由表可知，回收率計算為99%，相對標準偏(RDS)計算值為3.2%，小于10%，表明測量的精度較高。

表1 樣品濃度回收率Tab 1 Recovery rate of sample concentration

3 結 論

研究通過使用磺胺二甲嘧啶的單克隆抗體與SPR 生物傳感器檢測PBS 緩沖液中的磺胺二甲嘧啶，對照牛奶中添加不同質量濃度的磺胺二甲嘧啶，得到標準曲線，最低檢測限為2.4 mg/L。樣品只需簡單的稀釋、離心處理即可直接測量，可以實現牛奶樣品中的磺胺二甲質量濃度范圍為3 ～48 mg/L，單個樣品前處理5 min，測量約7 min，整個過程在16 min 之內完成，能夠滿足實際檢測過程的需要，這種方法簡單快速，抗體無需標記，樣品基質的影響小，與抗原具有中等親和力的抗體和洗脫，配合適當的樣品前處理方法，可以用以檢測抗體對應的小分子物質，具有廣泛的應用前景。

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