改良“二次枕大池注血法”構建Wistar大鼠蛛網膜下腔出血模型☆

馬朝暉李貴福羅望池黃燕

李鐵林*

改良“二次枕大池注血法”構建Wistar大鼠蛛網膜下腔出血模型☆

馬朝暉*李貴福*羅望池*黃燕*

李鐵林*

目的總結大鼠“二次枕大池注血法”構建蛛網膜下腔出血模型的經驗體會。方法通過對“二次枕大池注血法”進行步驟簡化及改良：①省去穿刺環枕膜、抽取腦脊液步驟；②不必完全顯露環枕膜。通過斷頭取腦后直接觀察判斷建模是否成功。結果術中死亡大鼠14只，成功復制蛛網膜下腔出血模型大鼠120只（89.6%）。術后35只模型大鼠出現意識改變、肢體偏癱等神經功能缺損癥狀（29%）。結論改良的“二次枕大池注血”法建蛛網膜下腔出血模型具有較高的成功率，控制穿刺進針角度及深度，控制注血量和注血速度，防止堵管是造模成功的關鍵。

大鼠 蛛網膜下腔出血 模型

自發性蛛網膜下腔出血是臨床神經科常見的重癥，有很高的致死率和致殘率，故其是基礎及臨床研究的熱點。“二次枕大池注血”構建蛛網膜下腔出血模型是目前最為認可的造模方式。因研究需要，我們采用Wistar大鼠進行 “二次枕大池注血”構建蛛網膜下腔出血模型134例，取得了一定的經驗，并對造模步驟進行了簡化，現匯報如下。

1 材料和方法

1.1 研究對象 SPF級Wistar大白鼠134只，雌雄各半，鼠齡10～12周，體質量250～320 g。由南方醫科大學實驗動物中心提供。主要器械：PSMB雙目動物手術顯微鏡（物鏡F200），顯微手術器械1套（主要包括顯微剪1把，直鉗及彎鉗各1把），眼科直剪和彎剪各1把，普通小彎鉗2把，動物手術固定板1快，20cm長線繩4根。

1.2 “二次枕大池注血”建模方法 10%水合氯醛（3 mL／kg）腹腔注射麻醉后，大鼠頭部及左側股動脈區備皮。常規消毒，取俯臥位，以枕外隆凸為中點取約1.0 cm直切口，分離皮下筋膜，從前向后正中縱行剪開淺層肌肉約8 mm，暴露頸夾肌間隙，小彎鉗牽開雙側夾肌，顯微剪稍進行分離，并初步定位枕骨、環椎及環枕膜，隨后大鼠改仰臥位，手術顯微鏡下暴露一側股動脈，用1 mL注射器抽取股動脈血0.3～0.4 mL，棉簽壓迫股動脈止血良好后，改俯臥位，小彎鉗牽開雙側夾肌，用注射器針頭沿枕骨下滑至枕骨大孔處刺破環枕膜并稍稍推進到達枕大池，在2 min內將血液注入枕大池；注血后環枕膜穿刺處填塞明膠海綿一塊，俯臥位頭低30°約30 min。以利血液沉積在腦底血管周圍，縫合頭部及股部切口。48 h后同法抽取另一側股動脈血0.2～0.3 mL（1 mL／kg）注入枕大池，制成大鼠SAH動物模型。

1.3 造模成功判定標準 在進行第2次注血時可發現大部分大鼠均存在少量血性腦脊液漏出，可證實穿刺位置在蛛網膜下腔；因實驗需要造模動物均需進行心臟心臟生理鹽水及4%多聚甲醛灌注后斷頭取腦，在取腦時可見腦底基底池均可見明顯蛛網膜下腔出血。

2 結果

術中死亡大鼠14只，成功復制蛛網膜下腔出血模型大鼠120只（89.6%）。術后35只（29%）模型大鼠出現意識改變、肢體偏癱等神經功能缺損癥狀。見圖1。

圖1 A：由前向后正中縱行剪開淺層肌肉約8 mm，暴露頸夾肌間隙，小彎鉗牽開雙側夾肌，顯微剪稍進行分離。B：注射器首先保持與背部15°～30°，針尖頂住枕骨，將針頭沿枕骨下滑到環枕聯合處，然后穿刺環枕膜，有透空感后，進針深度保持在5 mm以內。C：2次注血成功后即時斷頭取腦見基底池及腦表面明顯積血，腦組織腫脹。D：2次注血成功后心臟生理鹽水及4%多聚甲醛灌注后斷頭取腦，腦干、基底池均可見明顯蛛網膜下腔出血。E：2次注血造模1 d后大鼠右側肢體偏癱。

3 討論

目前針對蛛網膜下腔出血后繼發腦血管痙攣和腦缺血的實驗研究較多，其動物實驗的主要造模方法有“單次枕大池注血法”、“二次枕大池注血法”、顱內血管穿刺法或顱內動脈周圍致痙攣物質或縮血管物質法［1，2］。“單次枕大池注血法”引起腦血管痙攣發生率低，在顱內動脈周圍注入致痙攣物質或縮血管物質法又因為與蛛網膜下腔出血發病機制存在區別而較少人采用［1］。故目前多以“二次枕大池注血法”、顱內血管穿刺法為主，但后者由于損傷大，容易造成腦組織損傷以及出血量不容易控制，容易引起大鼠死亡，死亡率達到16%～44%［2－4］。“二次枕大池注血法”操作簡單，效果明顯，易施行血管造影，動物死亡率低，如操作熟練，甚至可到達零死亡［5］，而且費用較低，被認為是較為理想的癥狀性CVS動物模型，故應用最為廣泛［2，6－8］。本研究參考Pereira等的“二次枕大池注血法”造模方法［8］，并進行了步驟的簡化以及部分改良：①省去穿刺環枕膜、抽取腦脊液步驟。此步驟目的主要為確定穿刺針是否在蛛網膜下腔。此步驟可以考慮省略。在本組實驗過程中，采取股動脈采血后直接穿刺環枕膜。在定位環枕膜時可將針頭沿枕骨下滑到環枕聯合處，然后穿刺環枕膜，有透空感后注射血液。②不必完全顯露環枕膜。如果要完全顯露環枕膜，則需充分分離頸部肌肉，而在分離枕部粗隆及環椎肌肉附著點時容易引起出血。可以以枕外隆凸為中點取約1.0 cm皮膚直切口，分離皮下筋膜，由前向后正中縱行剪開淺層肌肉約8 mm，暴露頸夾肌間隙，小彎鉗牽開雙側夾肌，顯微剪稍進行分離，并初步定位枕骨、環椎及環枕膜，然后在穿刺時將針頭沿枕骨下滑到枕骨大孔邊緣，然后穿刺環枕膜，有透空感后注射血液。同樣可達到準確穿刺（圖1）。此兩個環節可節省時間5～10 min，減少了穿刺損傷致死或組織損傷的可能。吳氏報道［9］采用直接經皮穿刺，但在實際操作中，由于大鼠頸部皮膚非常松弛，穿刺時位置容易變動，而且皮下肌肉組織未進行分離，定位環枕膜比較困難，可能需要反復的穿刺，反而增加了損傷，故適當的分離有助于穿刺成功。建模的成功與否與術者的經驗直接相關，本組大鼠的死亡主要發生在預實驗階段（6／20），實驗階段早期前30只大鼠建模術中死亡2只（6.7%），中期54只死亡6只（11.1%），而后30只大鼠無1只術中死亡。

在整個建模過程中，決定建模成功的主要還有以下幾個環節：①穿刺進針角度及深度。在本實驗中，大鼠采用俯臥位，為避免穿刺針扎傷腦干，注射器應保持與背部15°～30°，針尖頂住枕骨，將針頭沿枕骨下滑到環枕聯合處，然后穿刺環枕膜，有透空感后，進針深度保持在5 mm以內，注射血液時順暢，無明顯阻力，如果阻力較大，而且大鼠突然出現呼吸心率改變，可能損傷了腦干，如單純阻力大，考慮血栓堵塞可能，應予以更換，或者清除血栓。②注血的量和速度。注血的量目前無統一標準，Takata第一次注射采用0.5 mL，第二次注射0.3 mL［5］，吳氏報道采用 0.2mL［9］，Germano采用0.4 mL［10］。注血的量與發生腦血管痙攣的有明顯的相關性，但注血量多容易造成大鼠死亡導致造模失敗。在本組實驗中后期，我們采取1 mL／kg的注血量，明顯比預實驗降低了死亡率，而能達到同樣效果。注血的速度至為關鍵，太快可引起大鼠立即死亡，太慢容易導致血栓形成以致堵管。建議以0.15 mL／min的速度（默數1～20后注射0.05 mL）。③防止血栓形成堵管。血栓形成既可以造成堵管，亦可浪費采集的血液，故采血及止血應盡快完成。在采完血后，由助手迅速用棉簽壓迫穿刺口止血，術者同時解開大鼠的綁縛，壓迫2 min左右，穿刺口無滲血后，填塞明膠海綿一塊。如為縮減時間，可在棉簽壓迫同時，以紗塊制成棉墊覆蓋在棉簽上加壓，迅速將大鼠改成俯臥位，然后再穿刺注血。即使如此，血栓形成仍難以避免，故在采血時，可適當比預定血量多采0.1～0.2 mL。堵管時，退出注射器及針頭，檢查血栓位置，并清除血栓，然后再進行穿刺，如反復堵管，可反復清除，必要時更換針頭。切不可堵管時盲目加壓注射，造成注射器的不可控制而刺傷腦干。

由于蛛網膜下腔出血的高致死率和致殘率同樣在實驗動物身上也會出現，故從動物實驗倫理而言，術者應盡可能的降低手術創傷，提高建模的成功率。

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［2］Jeon H，Ai J，Sabri M，et al.Neurological and neurobehavioral assessment of experimental subarachnoid hemorrhage［J］. BMC Neurosci，2009，10（8）：103.

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2011－08－28）

（責任編輯：甘章平）

10.3969／j.issn.1002－0152.2012.03.012

☆ 廣州中醫藥大學博士后科學研究資助項目 （編號：BBK429112K06）；廣東省財政廳專項經費（編號：粵財社2010－5）

* 廣東省中醫院腦病三科（廣州 510120）